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毛细管电泳分离筛分介质的选择 王荣“一，刘勇L2贾正平1，高岚2，谢华1张强1，郭志强1 兰州 1(兰州军区兰州总医院国家药物IJ盏床试验I期研究室 730050) 2(兰州大学生命科学学院兰州 730000) 近年来，毛细管电泳(cE)已成为分离生物大分子的重要手段，在分子生物学、分子医学、 法医学等领域得到越来越广泛的应用…。在CE分离生物大分子过程中，筛分介质的性能直 接影响其迁移特性、分离度、读出长度、重现性、注入时间、注入压力以及毛细管寿命等， 因此筛分介质的选择尤为重要，它是样品成功分离的关键，一直是研究的热点【2-5l。黄欢等【6】 对用于CE和芯片电泳分离DNA的筛分介质进行了总结，随着CE的广泛应用，其分离对 象也随之扩大，如多肽，蛋白质等。本文将筛分介质可分为凝胶筛分介质和无胶筛分介质， 对其在生物大分子分离分析中的应用进行综述。 1凝胶筛分介质 凝胶筛分介质主要是琼脂糖(AG)或交联聚丙烯酰胺(PAM)【71，这种筛分介质分离效率较 好，在CE早期研究中得到广泛应用，但缺点也十分明显：毛细管柱制备困难、凝胶容易断 裂和产生空泡、稳定性差、柱寿命短且重现性不好【8】。 1．1琼脂糖 AG容易成胶，孔径大且透光性好，是很好的抗对流介质，最初用于平板凝胶电泳，后 来利用其加热液化、冷却胶化可以容易地将所需凝胶灌入和吸出毛细管的特点，1988年 一定量的AG和一定体积的缓冲溶液在水浴中(低于100C))Jfl热溶解，保持温度将溶液吸入 涂层(不带电荷、不产生电渗的)毛细管中，4C放置30～60min即可形成可用凝胶管。但是， AG较难键合固定到毛细管壁上，易滑动；加热后会重新液化，电泳温度过高会产生液化流 失现象，因此使用几次后应重新灌制。1991年，Motsch等㈣提出了详细的AG柱制备方法， 利用凝胶熔点低的特点，将90C的AG缓冲溶液注入毛细管，室温冷却即可成胶。利用这 种体系分离DNA内切片段和磺化二糖，取得了很好的效果。 1．2交联聚丙烯酰胺 管，以消除毛细管内壁对蛋白质的吸附，并利用这种方法对多种蛋白质进行了分离，取得了 很好的分离效果。交联聚丙烯酰胺由丙烯酰胺单体和交联剂聚合而成，通过改变凝胶孔径的 大小，从而对被分离组分起到分子筛的作用。优点是吸附很小，消除电渗现象；减小分子扩 散，抗对流；具有分子筛效应，迁移时间能反映组分分子量大小；在一定范围内透明，机械 ‘国家自然科学基金(N020775089)和国家自然科学基金(No资助 288 强度好，有弹性。但其制备复杂、不易使用、产生的气泡会中断电路，一些大分子积留会影 响柱寿命。Paulus等112】对杂寡聚核苷酸等进行分析，同平板电泳的比较显示了良好的分离性 能。周瑾等㈣以高分辨低粘度可替换的部分交联聚丙烯酰胺作为毛细管凝胶电泳的筛分介 质，实现了溶菌酶、细胞色素C、核糖核酸酶A和胰蛋白酶4种碱性蛋白的基线分离。 2无胶筛分介质 无胶筛分介质为非交联的高分子溶液，无复杂的凝胶制备过程，溶液易于充入和洗出、 操作简单、筛分介质可以替换、可重复使用且具有高效、快速和自动化分离等优点【14】。常 用的无胶筛分介质主要有均聚物、共聚物、混合物和添加剂。 2．1均聚物 这类聚合物主要由单聚体组成【14】，如线形聚丙烯酰胺(LPA)、聚乙烯吡咯烷酮(PvP)、 聚环氧r,熄PEO)、聚乙二醇(PEG)、纤维素及其衍生物、聚M肛二甲基丙烯酬A(PDMA)等。 根据毛细管无胶筛分理论，均聚物在溶液内形成交缠网络结构，不同样品按照不同的迁 移行为通过毛细管柱而得到分离。由于不同聚合物亲水性、分子量大小、自涂敷能力不同， 分离效果也有很大的差别，目前主要使用的均聚物有以下几种： 2．1．1 LPA LPA是由单体丙烯酰胺在一些能够提供游离基的催化．氧化还原系统中聚合而成。具有 制备简单，易于更换凝胶，背景污染少；纯度高：机械强度好，又可以避免气泡的产生，寿 命长等优点，尤其在分离长度和分离时间上的优良性能，应用较为广泛也是最为成熟的一种 线性高分子。但也存在许多缺点：高相对分子质量的LPA溶液难以泵入毛细管，装柱困难； 孔径大小很不均一，定量表征比较困难；丙烯酰胺单体为一种剧毒的致癌物，使用不方便； 溶解高