复习单克隆抗体练习.pptVIP

复习单克隆抗体 （1）融合后的杂种细胞容易成活吗？ （2）制备单克隆抗体的过程应用了哪些细胞工程技术手段？ （3）在整个制备的过程中要经过几次筛选？ 三.思考与探究 1.植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术有什么不同？ 2.制备单克隆抗体时，为什么要选用B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞？ 2.为什么不用两个而要用多个细胞进行动物细胞间的融合？ 就目前常用的细胞融合方法来看，不管是用物理的、化学的方法，还是生物的方法，其融合率都不可能是100%。仅用两个细胞融合，其效率太低，不一定能得到融合细胞。更重要的是，即使两个细胞已发生融合，但并不一定是研究者期望得到的细胞类型。目前动物细胞融合技术最有价值的应用就是单克隆抗体的制备。我们以制备单克隆抗体为例来说明这一问题。我们知道，体内产生的特异性抗体种类可多达百万种以上，但是每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体，如果仅取一个脾细胞（含B淋巴细胞）和一个瘤细胞杂交，我们不能确定该脾细胞分泌的抗体是否正是我们所需要的；若用大量的脾细胞和瘤细胞进行融合，就可以从融合细胞中筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。 3.如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养？ 融合后的细胞经选择性培养基培养后，能存活的细胞就是杂交瘤细胞。但这些杂交瘤细胞并非都是能分泌所需抗体的细胞，通常用“有限稀释法”来选择。将杂交瘤细胞稀释，用多孔细胞培养板培养，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖。然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体（常用酶联免疫吸附试验法），那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行3～4次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。该过程即为杂交瘤细胞的克隆化培养。 第一次筛选： （1）筛选对象：脾细胞、瘤细胞、脾-脾细胞、瘤-瘤细胞、脾-瘤细胞（即羊红细胞免疫过的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合后得到的细胞混合液）。另有少量多细胞聚体，因寿命短而迅速死亡，故无需特殊筛选。 （2）筛选方法：用HAT选择培养基筛选出正常生长的细胞。（注重：HAT培养基含有次黄嘌呤H、氨基喋呤A和胸腺嘧啶核苷T。其中氨基喋呤能阻断核酸合成的主通路，而次黄嘌呤在磷酸核糖转移酶HGPRT的催化下能合成RNA或胸腺嘧啶核苷在胸腺嘧啶核苷激酶TK的催化下合成DNA均属于核酸合成的旁通路。） （3）筛选结果：脾-瘤细胞正常生长，其它细胞都会死亡。（析因：脾细胞和脾-脾细胞的核酸合成主通路被氨基喋呤阻断，虽有核酸合成的旁通路，但不能长期增殖；瘤细胞和瘤-瘤细胞缺乏核酸合成旁通路的酶，核酸合成主通路又被氨基喋呤阻断，因核酸合成障碍而死亡；脾-瘤细胞具有脾细胞的核酸合成旁通路酶，虽核酸合成主通路被氨基喋呤阻断，但可利用培养基中的次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷合成核酸而得以生存。） 第二次筛选： （1）筛选对象：多克隆杂交瘤细胞群体。（即产生多种抗体的脾-瘤细胞混合群体。） （2）筛选方法：抗体检测（ 如 免疫荧光技术、放射免疫技术等，实际上是利用稀释法，在聚乙烯微板孔内逐个杂交瘤细胞分开培养，然后检查每孔中产生特定抗体的能力）。 （3）筛选结果：产生专一性抗体的杂交瘤细胞。 书上说的B淋巴细胞是指效应B细胞（浆细胞），只有已免疫的B淋巴细胞（即效应B细胞）才能分泌抗体。浆细胞有专一性，还要进行抗体阳性检测是因为：第一次用选择培养基筛选出的杂交瘤细胞有多种，因为当初取自小鼠脾脏的效应B细胞有多种，总共能分泌多种不同抗体，这次筛选只是去处未融合细胞和同种融合细胞，所以最后体内体外培养前还有一步分离各种杂交瘤细胞，专一抗体阳性检测是为了保证我们现在所需要制备的这种单克隆抗体一直存在，避免实验操作失误导致产生的这种单克隆抗体的杂交瘤细胞死亡 既然浆细胞有专一性，用特定抗原刺激时，应该只产生一种效应B细胞啊，为什么会有多种呢? 考虑到实际上生活中动物每时每刻都在进行免疫反应，空气中就有各种病原体。试验中用特定抗原刺激时，一定会产生相应效应B细胞，但不等于没有别的效应B细胞 动物细胞工程小结 动物细胞培养：原理、营养、条件、过程、细胞生长特点、结果、应用 动物细胞融合：原理、诱导方法、过程、应用 单克隆抗体的制备：原理、过程、特点、应用 核移植与克隆动物：供体、受体、核移植方法、克隆动物的方法、克隆动物的遗传特性、应用 动、植物细胞工程的比较：植物组培技术与动物细胞培养技术、植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术 课后习题 1. 单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B淋巴细胞 诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞， 在这种培养基上不能存活增殖的细胞是 （ ）