改进的大鼠原代Kupffer细胞分离与鉴定方法.pdfVIP

临床与实验病理学杂志 JClinExpPathol2012Apr；28(4) ·455 · 改进的大鼠原代Kupffer细胞分离与鉴定方法 刘 飞 ，吴中平 摘要：目的 改进原分离方法，探索出一种稳定性强、经济实 公司)。抗兔二抗 Dylight488(EarthOx)。214型碳素墨水 用、高纯度的大鼠原代 Kupffer细胞(Kupffercells，KC)的分 (上海墨水厂)。恒流电子蠕动泵 (上海之信公司)，用医用 离方法。方法 (1)原位胶原酶灌注法；(2)Percoll液不连 输液器搭置输液装置 ，硅胶管作为蠕动管。离心机 Muhifuge 续的密度梯度离心以分离 Kupffer细胞 ；(3)选择性贴壁纯化 1S-R(Thermo)。荧光倒置显微镜CKX41(Olympus)，CO，培 Kupffer细胞；(4)Kupffer细胞吞噬墨汁实验、CD68免疫荧光 养箱 (Thermo)。 染色鉴定。结果 Kupffer细胞得率 ≥(7～8)×10’／肝，纯 1．2 试剂配制 第一灌注液：D—Hanks液300ml，加 1kU肝 度I98．0％，Kupffer细胞吞噬活性强。结论 此方法稳定 素。第二灌注液：Hanks液 100ml，加Ⅳ型胶原酶25mg。孵 性强、经济实用、KC纯度高及性能优 良，可满足 PRC、West． 育液 ：Hanks液5Oml，加Ⅳ型胶原酶25mg。Percoll原液：临 ernblot等分子生物学所需要的原代细胞数。 用前用生理盐水或有颜色的 RPMI1640以70％ (15m1)、 关键词 ：Kupffer细胞；细胞分离 ；梯度离心 30％(2om1)浓度配制，现配现用，确保两种浓度的颜色差异 中图分类号：Q2-33 文献标识码：A 明显，以使分层清晰。培养液：250ml的RPMI1640+27．7 文章编号：1001—7399(2012)04—0455—03 ml的胎牛血清十50 l的mycoplasma—out~CD68一抗用 PBS 1：100稀释，Dylight488用PBS1：200稀释；墨汁：5Oml生 Kupffer细胞(Kupffercells，KC)是机体内单核巨噬细胞 理盐水 +20 1墨汁，高温高压灭菌。 系统成员，虽只占肝细胞总数的 15％，但占单核巨噬细胞系 1．3 灌注、分离、纯化方法 统总数的80％一90％ ，它们主要位于小叶门静脉区，具有 1．3．1 肝脏的原位灌注和消化 20％的乌拉坦(1ml／0．2 吞噬、分泌、免疫调节与监视作用。KC可被内毒素脂多糖 kg)麻醉、固定，75％乙醇腹部视野消毒 ，3min后取正中切 口 (LPS)等激活，释放肿瘤坏死因子 (TNF一仅)、转化生长因子、 入腹，分别暴露门静脉和下腔静脉，用玻璃分针游离。布2 干扰素(IFN)、白细胞介素、一氧化氮等细胞因子和炎性介 根3号线穿过门静脉以固定套管用 ，从远端下腔静脉注入 质。KC的活化是炎症发生、发展的关键因素之一 J，而过量 200U肝素。在距肝门约2cm处插入 18G静脉套管针 (过 的细胞因子和炎性介质的分泌更可以导致全身炎性反应综 门静脉第一分支人 口则可，勿深入肝门)，拔针，用线固定套 合征 。因此，分离足够量、功能完整的原代 KC有助于深 管。接上输液装置，用预热的37℃第一灌注液灌注，流速 入开展炎症机制及干预作用的研究。但 KC增殖能力极弱、 40ml／min，待肝脏膨胀、充盈 ，再剪开远端下腔静脉 (防血 分离纯化较难，成本较高，我们在其它实验的基础上 j，经 溅)，用止血钳夹住 ，并间歇性开放，使肝脏交替膨大、回缩， 过多次实验，探索出一种稳定性强，经济实用，高纯度及性能