转氨酶活性的测定.pptVIP

转氢酶(GOT、GPT)的提取和测定(分光光度法) 实验目的 熟悉转氨酶的测定方法。 实验原理 氨基酸分子上的氨基转移到α—酮酸分子上的反 应，称为转氨反应，由转氨酶催化。谷氨酸—草 酰乙酸转氨酶(GOT)和谷氨酸—丙酮酸转氨酶 (GPT)是两种最普遍的转氨酶。 GOT能催化如下反应： 此反应可与苹果酸脱氢酶相偶联，从而用来测定该酶的活性。 测定NADH在340nm或366nm处的吸光度的变化， 即可计算GOT的活性。 GPT能催化如下反应： 反应与乳酸脱氢酶相偶联， 生成的丙酮酸转化为乳酸，NADH变成NAD+ 测定340nm处NADH的OD值， 即可计算GPT的活性。 器材与试剂 1．实验仪器 搅拌器，紫外分光光度计，冷冻离心机，试管，烧杯 2．实验试剂 苹果酸脱氢酶，乳酸脱氢酶， 3mg／ml NADH，0.005mol／L α-酮戊二酸， 0．2mol／L D,L—天门冬氨酸盐， 0．2mol／L D,L—丙氨酸 (以上试剂均用0.05mol/L Tris—HCl(pH 7．2)缓冲液配制 3．实验材料 日本珊瑚树嫩叶 实验步骤 1．酶粗提液的制备 称取植物材料日本珊瑚树嫩叶 1g，按质量g:体积=1:9 的比例，加入9倍体积PH7.2的0.05mol/L Tris—HCl缓冲 液，用搅拌器进行搅拌 使之混匀，得到的匀浆在0℃下用20 000g离心20min，上 清液即为酶的租提液。 2．酶活性的测定(分光光度法) 操作过程： (1)ＧＯＴ活性的测定 按表下表所示加入溶液体积数，配成COT反应液。 混匀，室温放置5 分钟，505nm 波长，双蒸水调零，测各管 OD 值。 以（绝对OD 值=测定管OD 值－对照管OD 值），查标准曲线，求得相应的AST∕GOT活力单位。 (2）ＧＰＴ活性的测定 按下表所示加入溶液体积数，配成GPT反应液。 混匀，室温放置5 分钟，505nm 波长，双蒸水调零，测各管 OD 值。 以（绝对OD 值=测定管OD 值－对照管OD 值），查标准 曲线，求得相应的ALT∕GPT活力单位。 先计算得到每μmol NADH的0D值，则可计算酶的活性大 小。为此先读取未加酶时反应的0D值，除以反应液中 NADH的量(3mg／ml=4.5mmol)，即0D／4500 μmol，就 可以得到1μmolNADH被氧化时0D的变化值。 计算公式： 注意事项 1、比色法中常用的有赖氏（Reitman-Frankel）法及金氏（King）法。赖氏法标准曲线所定单位数，是用实验方法和卡门氏分光光度法（速率法）作对比测定求得的。以卡门氏单位报告结果，比较准确。 卡门氏单位定义：1ml 液体，反应液总容量 3ml，340nm 波长，1cm 光径，25℃，1min 内所生成的丙酮酸，使NADH氧化成NAD+而引起吸光度每下降 0.001 为一个卡门氏单 位。 （1 卡门氏单位=0.482IU/L,25°C） 2、当标本酶活力超过 150 卡门氏单位时，应用生理盐水将标本稀释后进行测定。 3、加入 2，4-二硝基苯肼溶液后，应充分混匀，使反应完全，加氢氧化钠溶液方法要一致，不同方法会导致吸光度读数的差异。 附1：AST∕GOT标准曲线 附2：ALT∕GPT标准曲线 实验作业 转氨酶的主要类型及其各自的特点是什么? The end thank you! 本实验计算只需根据AST∕GOT和ALT∕GPT标准曲线计算公式求得对应的卡门氏单位即可。