3-样品处理方法3-分光光度与标准曲线.pptVIP

标准曲线法 通过检测已知物质不同浓度（分子量、色度等）的吸光值，以物质浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标； 在EXCEL状态下，显示各点的相关性，作为下一步检测的计算标准。 标准曲线法操作步骤 配制剃度溶液 检测吸光值 检测待测物质的吸光值 将测待测物质的吸光值代入曲线方程计算 举例： Folin-酚法测定可溶性蛋白浓度 试剂配制注意事项 分光光度操作注意事项 检测与计算 1 Folin-酚试剂的配制 Folin-酚法测定蛋白含量适用于微量可溶性蛋白含量的测定。比如蛋白酶比活力测定、凝胶层析等。 Folin-酚试剂的试剂甲现用现配，不可存放过久； Folin-酚试剂的试剂乙配制困难，但可在棕色瓶中低温久藏不变性。 1.1 Folin-酚试剂甲的配制 (a)4%碳酸钠溶液； (b)0.2mol/L氢氧化钠溶液； (c)1%硫酸铜(CuSO4?5H2O)； (d)2%酒石酸钾钠溶液。 注意 在使用前，将(a)与(b)等体积混合配成碳酸钠-氢氧化钠溶液，将(c)与(d)等体积混合配成硫酸铜-酒石酸钾钠溶液。然后将这两种溶液按50:1的比例混合，即为Folin-酚试剂甲。该试剂只能用一天，过期失效。 1.2 Folin-酚试剂乙的配制 往1.5L磨口回流瓶加入 100g钨酸钠(Na2WO4?2H2O)， 25g钼酸钠(Na2MoO4?2H2O)及700mL蒸馏水，50mL85%磷酸及100 mL浓盐酸充分混合，接 上回流冷凝管，以小火回流10h，回流完毕，再加入150g硫酸锂，50mL蒸馏水及数滴溴水，烧开后继续沸腾15min，以除去多余的溴，冷却后稀释至100 mL，过滤，得到的滤液待标定。 1.3 Folin-酚试剂乙的标定 准确吸取试剂滤液1.0mL，稀释至100mL，从中吸取10mL两份，各置50mL三角瓶中，各加入数滴酚酞，用已标定的氢氧化钠溶液进行中和滴定，计算其摩尔浓度。再将得到的100 mL左右的滤液稀释为1mol/L盐酸浓度的溶液，置于棕色瓶中，放冰箱中保存备用。 2 标准蛋白质溶液配制 标准蛋白质溶液的配制：称取50mg牛血清白蛋白，加水溶解，定容至50 mL，即为1000μg／mL的标准蛋白质溶液。 2.1 蛋白质标准曲线的绘制 取6支试管，分别加入0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL标准蛋白质溶液，用水补足到1mL，摇匀；按顺序向各管加入2mL Folin-酚试剂甲，室温下静置10min，加入0.2mL Folin-酚试剂乙，摇匀，室温下静置30min，分别在分光光度计上（500nm）处测定各浓度蛋白质的吸光值。空白以1mL蒸馏水代替标准蛋白质溶液，其余操作相同。 2.2 蛋白质标准曲线的绘制 以蛋白质浓度为横坐标，以各浓度的吸光值为纵坐标，绘制牛血清白蛋白标准曲线。 * *