第五节 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(一).docVIP

　　 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数（一） 主讲：黄冈中学优秀生物教师　王小敏 课题背景： 1、尿素的利用 　　尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。 2、细菌利用尿素的原因 　　土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶 　　CO(NH2)2＋H2O CO2＋2NH3 3、常见的分解尿素的微生物 　　芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。 4、课题目的 　　①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌。 　　②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。 一、研究思路 （一）筛选菌株 1、实例：DNA多聚酶链式反应（PCR)是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温（93℃）的DNA聚合酶。该酶存在于水生嗜热菌（Thermus aquaticus)中。 　　问题：为什么Taq 细菌能从热泉中被筛选出来呢？ 　　原因：因为热泉温度70～80℃，淘汰了绝大多数微生物只有Taq细菌被筛选出来。 　　启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。 2、实验室中微生物的筛选原理： 　　人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。 　　要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等； 　　方法： 　　（1）抑制大多数微生物不能生长； 　　（2）造成有利于该菌生长的环境。 　　结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。 3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基： KH2PO4 1.4g NaH2PO4 2.1g MgSO4·7H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g 琼脂 15.0g 　　①从物理性质看此培养基属于哪类？固体培养基 　　②在此培养基中哪些作为碳源、氮源？ 　　碳源：葡萄糖、尿素氮源：尿素 4、培养基选择分解尿素的微生物的原理 　　培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。 （二）统计菌落数目 计数法：直接计数法、平板计数法、比浊法、膜过滤法 1、直接计数法：最常用的显微镜直接计数法。 　　显微镜直接计数：先将待测样品制成悬液，利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。根据在显微镜下观察到的微生物数目来计算出单位体积内的微生物总数。 　　缺点：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数； 　　需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察； 2、间接计数法（活菌计数法） 　　（1）原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。 　　（2）常用方法：稀释涂布平板法。 　　每克样品中的菌落数＝（C÷V)×M 　　C：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数， 　　V：代表涂布平板时所用的稀释液的体积（ml)， 　　M：代表稀释倍数。 例1、某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每克样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1ml）（　） A．2.34×108　　　　　　 　　B．2.34×109 C．234　　　　　　　　　　　D．23.4 例2、两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数106的培养基中，得到以下两种统计结果。 　　1、第一位同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。 　　2、第二位同学在该浓度下涂布了三个平板，统计的菌落数分别为21、212和256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。 　　你认为哪位同学的结果接近真实值？你认为这两位同学的实验需要改进吗？如果需要，如何改进？ 分析： 　　第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。 　　第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了3个平板，但是，其中第1个平板的计数结果与另2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。 启示： 　　在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。 例3、样品的稀释程度将直接影响平板上生长的菌落数目。实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板。 　　测定土壤中细菌的数量，一般选用1