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分子生物学实验一、二 重组DNA的制备、提取与酶切鉴定 实验原理 1、CaCl2法制备感受态细胞：感受态是指受体细胞处于容易吸收外源DNA的一种生理状态。细菌处于0℃的CaCl2低渗溶液中，会膨胀成球形，细胞膜的通透性发生变化，转化混合物中的质粒DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经过42℃短时间的热激处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富的培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，在选择培养基上可获得所需的转化子。pBR322质粒携带有抗氨苄青霉素的基因，因此接受了该质粒的受体菌具有抗氨苄青霉素的特性。将经过转化后的受体细胞在含Amp的平板培养基上培养，未受转化的受体细胞则因无抵抗Amp的能力而死亡，转化体因含有pBR322质粒而有抗Amp特性，从而可以正常生长。 2、碱裂解法小量制备质粒DNA：碱裂解法是利用线性大分子染色体DNA与小分子环形质粒DNA的变性复性的差异从而进行分离，在pH12.0～12.6的碱性环境中，线型染色体DNA和环型质粒DNA氢键会发生断裂，双链解开而变性，但质粒DNA由于其闭合环型结构，氢键仅发生部分断裂，而且其互补链不完全分离；当将pH值调节到中性并在高盐浓度下，已分开的染色体DNA互补链不能复性而交联形成不溶的网状结构，通过离心，大部分染色体DNA、不稳定的大分子RNA和蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去，而部分变性的闭合环状的质粒DNA在中性条件下很快复性，恢复到原来的构型，呈可溶性状态保存与溶液中，离心后上清中便含有所需要的质粒DNA。继续利用试剂盒（柱法）提纯质粒DNA。 3、限制性内切酶：是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶，是体外剪切基因片段的重要工具，主要存在于原核生物中。剪切后的核酸末端分粘性末端与平端。根据实验需要选择合适的限制性内切酶进行酶切，可以达到想要的片段从而进行下一步有目的性的DNA重组。 4、琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖溶化再凝固后能形成带具有一定形状、大小与孔隙度的固体基质 (密度与琼脂糖浓度相关)；而生理条件下，核酸分子的磷酸基团呈离子化状态带负电荷，因此将核酸分子置于电场中时，它们会向正极迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移率取决于核酸分子本身的大小和构象。分子量较小的DNA分子，比分子量较大的DNA分子，具有较紧密的构型，所以其电泳迁移速率也就比同等分子量的松散型的开环DNA分子或线性DNA分子要快。从而在控制影响DNA迁移速率的其他条件下，DNA迁移速率的快慢取决于DNA的bp多少。琼脂糖凝胶电泳可以观察DNA片段大小，分解情况，有无RNA污染等等，是质控的重要环节。 实验步骤 1. 目的基因c-myc与pBR322质粒载体的连接(粘端) 2012.9.13 目的基因片段（1.4kb），20ng/μl 2.5 μl 载体DNA（4.3kb），20ng/μl 2.5 μl 10 × buffer 1 μl T4 DNA 连接酶（10U/ μl) 0.5 μl ddH2O 3.5 μl 总体积 10 ul 混匀，短暂离心，16 ℃水浴中温育2~4小时，4 ℃保存备用。 2. CaCl2法制备感受态细胞 取0.1ml大肠杆菌HB101培养物，加至5ml LB培养液中，37 ℃振摇约2h，细菌长至云雾状，倒入15ml经冰预冷的离心管，冰浴10min；4℃，4000rpm，离心10min ，弃上清，在纸巾上倒置，控干液体，沉淀重悬于冰预冷的1ml，0.1mol/L CaCl2，吹打混匀，转入1.5ml离心管，冰浴10min ；4℃，4000rpm，离心10min，弃上清，控干液体，重悬于200μl 0.1mol/L CaCl2分装成50 μl /管，共2管。 3. 重组质粒转化感受态细胞 1μl 连接产物或阳性对照加入50 μl感受态细胞，冰浴30min，42 ℃水浴 90sec，立即冰浴1~2min，分别加入LB培养液150 μl ，37 ℃振摇45min，分别取100μl 铺板于含Amp的LB平板，37 ℃温箱培养过夜。 4.挑克隆 2012.9.19 在50ml离心管中加入10ml含有60μm/ml Amp的LB培养液，从实验组平板上挑取含有希望得到的含有重组DNA的单菌落接种其中，37℃培养过夜。 5.质粒DNA的小量快速制备（试剂盒） 2012.9.20 将细菌培养物全部倒入15ml离心管，4500rpm，5min，弃上清，沥干。加250μl Buffer S1，吹打混匀，转入1.5ml离心