BacMan-标记法分析细胞内组蛋白翻译后修饰水平.pdfVIP

A p p l i c a t i o n N o t e 药 物 筛 选 BacMan- 标记法分析细胞内组蛋白翻译后修饰水平 Roland Leathers, Kevin Lowitz, Coby Carlson, Thomas Machleidt, Kun Bi, Justin Wetter and Matthew Robers, Invitrogen, 501 Charmany Drive, Madison, WI, USA; Peter Banks, BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA 关键词：BacMan- 标记 ，组蛋白 ，翻译后修饰 酶类通过翻译后修饰途径而调节组蛋白功能，是包括癌症在 内的很多疾病治疗性药物的研究靶点。本文通过 GFP 与组蛋 白融合，瞬时细胞内表达，然后采用 Lantha Screen® 细胞分 析法实现均相高通量组蛋白翻译后修饰研究。 介绍 真核生物的核小体由组蛋白 H2A ，H2B ，H3 和 H4 所组成， 可以调节染色体的结构使其按照特定方式进行基因的转录。 核小体的功能是直接调节氨基酸末端多种转录后修饰过程， 包括乙酰化，磷酸化，甲基化和遍在蛋白化作用。这些修饰 都属于紧凑型调节，并影响细胞的一些处理过程包括组蛋白 沉积，染色体组装，以及在有丝分裂减数分裂过程中染色体 图 1. HATs 活性和 HDACs 调节染色体结构和转录。 的沉积。因此一些组蛋白修饰酶被认为是疾病治疗过程中非 常有意义的干预靶点。 LanthaScreen® 细胞分析技术原理 LanthaScreen® 细胞分析技术将 GFP 基因和抑制信号转导通 将杆状病毒介导的基因传递技术 (BacMam)、LanthaScreen® 路中进行修饰的作用底物基因相融合。GFP 作为 FRET 过程 细胞分析技术和 SynergyTM H4 全功能微孔板检测仪结合起来， 中基于溶酶的免疫分析中修饰后特异性Tb- 标记抗体的受体。 形成一个强大的检测平台，对感兴趣的细胞系进行靶向性的 特定的转录后修饰可以通过 TR-FRET 的检测方法在微孔板检 组蛋白转录后分析。另外我们推出了 HTS- 兼容的细胞分析 测仪上进行检测。 方法，用于检测组蛋白 H3 在 Lys9 上的乙酰化作用、组蛋白 H3 在 Ser10 上的磷酸化作用以及组蛋白 H2B 的遍在蛋白化 作用状态。所有分析方法结合 SynergyH4 的高灵敏度基于滤 光片的检测光路形成了一套灵活的检测法，可以高通量测试 复合物对组蛋白翻译后修饰的影响能力。 HDACs 在染色体结构和转录中的作用 组蛋白脱乙酰基酶 (HDACs) 可以催化蛋白质赖氨酸残基上酰 图 2. LanthaScreen® 细胞分析法示意图。 基修饰的去除，这些蛋白包括组蛋白 H2A 的核心区，H2B ， H3 和 H4。HDACs 和组蛋白乙酰化酶一起共同调节组蛋白的 杆状病毒介导的基因传递 (BacMan) 乙酰化作用。组蛋白核小体的乙酰化平衡在很多基因的转录 杆状病毒是一种昆虫细胞病毒，经修饰后可以在哺乳动物细 过程中扮演着重要的调节角色。乙酰化降低和染色体结构浓 胞中表达蛋白。未经修饰的杆状病毒可以进入哺乳动物细胞， 缩相关并引起基因转录的抑制，而组蛋白的乙酰化则可以引 但是其基因不能被上游哺乳动物的启动子所识别而表达。无 起染色体结构的打开松弛，并激活转录过程。( 图 1) HDAC 论是修饰的或未修饰的杆状病毒，携带有哺乳动物的启动子， 抑制剂类药物的研发在肿瘤研领域非常活跃 1。这种药物研发 也都无法在人类细胞中进行复制或感染。 的活跃性从最近 F