2011级硕士实验课ELISA.pptVIP

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吉林大学基础医学院免疫学教研室 吉林大学基础医学院免疫学教研室 免疫学实验课 闫东梅 yxn345@ 第二次实验课 酶联免疫吸附试验 间接法ELISA实验原理 E E E 已知抗原包被酶标板 加入未知抗体(一抗) 加入酶标抗体(二抗) 加入底物,显色 封闭 洗板 洗板 实验分组 每组一块40孔的酶标板 每人一行 实验试剂与器材 试剂: 封闭液(1%PBS-BSA) 7ml 洗液(PBS-Tween20) 1瓶 抗OVA抗体 2支 酶标抗体(HRP-GaM) 5ml 底物 5ml 终止液(H2SO4) 2.5ml 器材: 酶标板 1块 200?l pipette 1把 1000?l pipette 1把 Tip (大/小) 若干 1.5ml EP管 若干 培养箱37℃ 1个 吸水纸 若干 包被:用0.05M pH9.6碳酸盐包被缓冲液将抗原(OVA,10?g/ml)稀释。100 ?l/well加入聚苯乙烯酶标板中,4℃ over night。次日,弃去孔内溶液。 封闭:加入150 ?l/well 1%PBS-脱脂奶粉,37℃ for 40mins。 加一抗:弃去封闭液,加倍比稀释的抗体100 ?l/孔(稀释与加板方法见后) 37℃孵育40mins ;孵育结束后,用PBS-T洗三次。 酶抗:酶标抗体 (HRP-羊抗鼠IgG),100?l/well ,置37℃孵育40mins,用PBS-T洗三次。 显色:于各反应孔中加入新鲜配制的底物溶液100?l/well。 终止:加50 ?l/well 2M硫酸(终止液)。(altering the pH) 判定: 肉眼观察:与阴性对照孔相比有明显呈色反应的为阳性孔,相对应的抗体稀释度为该抗体的效价。酶标仪测量: 490nm滤光片下测光吸收值(A),与阴性对照A值相比其比值≥2,相对应的抗体稀释度为该抗体的效价。 实验步骤 包被 固相支持物: 聚苯乙烯和聚氯乙烯有较强的非特异性物理吸附蛋白质的特性,被吸附的蛋白质的免疫学活性不发生改变(Ag-Ab结合) 包被缓冲液: 碳酸盐缓冲液(pH=9.6) 磷酸盐缓冲液(pH=7.2) Tris-HCL缓冲液(pH=7-8) 包被温度、时间: 4℃  18-24小时 包被抗原浓度: 10ug/ml 封闭的作用 包被时所用的抗原或抗体浓度较低,吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙,封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙,从而防止非特异性吸附,影响结果的准确性。如图: Coating Blocking E E E E After blocking After blocking E E Without blocking 封 闭 的 作 用 最常用的封闭剂: 0.5%-1%的牛血清白蛋白(BSA) 10%的小牛血清 1%明胶 包被:用0.05M pH9.6碳酸盐包被缓冲液将抗原(OVA,10?g/ml)稀释。100 ?l/well加入聚苯乙烯酶标板中,4℃ over night。次日,弃去孔内溶液。 封闭:加入150 ?l/well 1%PBS-脱脂奶粉,37℃ for 40mins。 加一抗:弃去封闭液,加倍比稀释的抗体100 ?l/孔(稀释与加板方法见后) 37℃孵育40mins ;孵育结束后,用PBS-T洗三次。 酶抗:酶标抗体 (HRP-羊抗鼠IgG),100?l/well ,置37℃孵育40mins,用PBS-T洗三次。 显色:于各反应孔中加入新鲜配制的底物溶液100?l/well。 终止:加50 ?l/well 2M硫酸(终止液)。(altering the pH) 判定: 肉眼观察:与阴性对照孔相比有明显呈色反应的为阳性孔,相对应的抗体稀释度为该抗体的效价。酶标仪测量: 490nm滤光片下测光吸收值(A),与阴性对照A值相比其比值≥2,相对应的抗体稀释度为该抗体的效价。 实验步骤 抗体的稀释方法 1.准备7个稀释管,做好标记。 2.每管加入PBS 500ul。 3.取出抗体原液500ul加入第一管,混匀后,取出500ul加入第二管,依此类推至第七管。 加样方法 1 2 空白 空白 依此类推 10:空白对照 1:阴性对照 抗原(OVA) 一抗(血清) 酶标二抗 - + - - - 阴性 空白 空白 + 2:阴性对照 + - + 阴性 洗 液(PBS-T)  磷酸盐缓冲液:(PBS) 吐温20(Tween 20): 非离子型表面活性剂 抑制蛋白质非特异性吸附于塑料表面 标记抗体常用的酶 辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP) 碱性磷酸酶

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