浙江大学生物化学实验甲葡聚糖凝胶层析法分离混合物.pptVIP

葡聚糖凝胶层析法分离混合物 1、原理 凝胶层析：指混合物随流动相经过有凝胶颗粒作固定相的柱子时，混合物中各物质因分子大小不同而被分离的技术。又称为分子筛层析或排阻层析。 层析用的凝胶为不溶于水的化学惰性物质，离子基团含量少，颗粒大小均匀，网眼大小的选择范围宽广，机械硬度高等特点。 常用的有葡聚糖凝胶（Sephadex）、聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Gel）及琼脂糖凝胶（Sepharose）。 葡聚糖凝胶层析法分离混合物 葡聚糖凝胶是多聚葡聚糖和环氧氯丙烷相互交联形成的三维网状结构。见图1.1。通过控制二者的配比及交联时的反应条件，获得具有不同网眼（孔隙）的凝胶。 交联度越大，网眼越小；交联度越小，网眼越大。网眼（孔隙）的大小决定了被分离物质能够自由出入凝胶内部的分子量范围，一般从几百到数十万不等。 葡聚糖凝胶层析法分离混合物 进行凝胶层析时，选择合适的葡聚糖凝胶装柱，待分离的物质通过此柱时，它们相互之间由于分子量大小各不相同，在固定相上的阻滞作用有所差异，所以在柱中以不同的速率移动。 葡聚糖凝胶层析法分离混合物 即分子量大于允许进入凝胶“网眼”范围的物质完全被凝胶排阻，不能进入凝胶颗粒内部，只随着溶剂在凝胶颗粒之间流动，因此阻滞作用小，流程短，先流出层析柱； 分子量很小的物质可完全涌入凝胶颗粒内部，阻滞作用大，流程长，移动速度慢，从层析柱中流出就较迟； 若物质分子量介于完全排阻物质和完全渗入凝胶物质的分子量之间，则在前二者之间从柱中流出，由此就可达到分离的目的。 葡聚糖凝胶层析法分离混合物 不同型号的葡聚糖用G表示（如G-25，G-100等），G后面的数字为凝胶的吸水量（毫升水/克干胶）乘以10得到的数值。 如G-25表示这号葡聚糖凝胶吸水量是2.5毫升/克干胶。 交联度大，孔隙小，吸水量少，反之亦然。 应根据工作目的选择合适型号的葡聚糖，以达到最佳分离效果。 葡聚糖凝胶层析法分离混合物 本试验采用葡聚糖凝胶G-75作为固相载体，它适用于分子量范围在3000-70000之间的混合物的分离。 当蓝色葡聚糖-2000（分子量在200万以上，蓝色），维生素B12（分子量1355，红色）和DNP-甘氨酸（分子量225，黄色）的混合物流经层析柱时，蓝色葡聚糖因完全被排除在凝胶颗粒之外而首先流出，维生素B12部分渗入凝胶颗粒内部而其次流出，DNP-甘氨酸则完全渗入凝胶内部而最后流出，从而将三种物质分开。 葡聚糖凝胶层析法分离混合物 凝胶层析的特点：设备简单，操作方便，本身不会与被分离物质相互作用，分离效果好，样品回收率高，因此被广泛用于高分子物质的分离提纯、分子量测定和脱盐等。 2、材料及试剂 1、试验材料 蓝色葡聚糖-2000，DNP-甘氨酸，葡聚糖G-25。 2、试验试剂 洗脱液：0.05mol/L Tris-HCl (pH7.5) –0.1mol/LKCl。 葡聚糖凝胶层析法分离混合物 3、操作方法 各步操作过程及注意事项详见讲义P-56。 4、实验结果及处理 仔细观察各管颜色，并用“+”纪录各管洗脱液的颜色强度。 以洗脱管数为横坐标，洗脱液的颜色强度（相对指示出洗脱液内物质浓度的变化）为纵坐标，绘制洗脱曲线。 * * 大分子 小分子 凝胶颗粒 洗脱 筛板 *