分子生物学6-分子克隆.ppt

分子克隆（基因工程） 前言 二十世纪40年代，基因分子生物学家确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA，而不是蛋白质 1944年O.T.Avery等证明了肺炎球菌转化因子是DNA 50年代，Waston和Crick揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制 深刻意义在于：解决了基因自我复制和遗传信息的传递问题 50年代末和60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说，并成功破译了遗传密码。 从而阐明了遗传信息的流向和表达问题 基因工程的诞生 70年代初，DNA限制性内切酶的发现和一整套DNA体外重组技术又为基因工程的发展奠定了坚实的技术基础。 1972年，美国学者Berg.P等人首次在体外把SV40（一种猴病毒）的DNA和噬菌体DNA分别切割，又将两者接在一起，成功地构建了第一个体外重组的人工DNA分子。 1973年，Cohen等人首次将体外重组的DNA分子导入大肠杆菌中，成功地进行了无性繁殖，从而完成了DNA体外重组和扩增的全过程。 基因工程这门新兴学科也就由此诞生了。 基本概念 基因工程的核心是重组DNA技术（recombinant DNA technique），又叫DNA克隆（DNA cloning）。 所谓克隆（clone）是指通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体。 在基因工程中所指的克隆，是指在体外对DNA分子按照既定目的和方案进行人工重组，并将重组分子导入适合的宿主细胞，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得该DNA分子的大量拷贝。 基本概念 这类克隆是在分子水平上操作，故又称分子克隆（molecular cloning）。由于研究对象常常是特异的基因片段，所以又称作基因克隆（gene cloning）。实现基因克隆所采用的方法及相关工作统称为基因工程（genetic engineering）。 基因工程与当前发展的蛋白质工程、酶工程以及细胞工程共同构成了当代新兴的学科领域——生物技术工程。生物技术工程的兴起为现代科学技术发展和工农业、医药卫生事业的进步提供了巨大动力。 主要内容 ①从复杂的生物有机体基因组中，分离出目的基因片段。 ②在体外，将目的基因片段连接到能自我复制的并且具有选择标记的载体分子上，形成重组DNA分子。 ③将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称宿主细胞），并与之一起增殖。 ④筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞克隆。 ⑤从筛选出的阳性克隆中提取出扩增的目的基因片段，供进一步研究使用。 ⑥将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之实现功能表达。 应用实例 重组DNA技术跨越天然物种屏障，将原核和真核生物，植物和动物，细菌和人，动物和人的基因连接起来，进行基因交流。 利用大肠杆菌（E.coli)、酵母、哺乳动物细胞表达系统来生产人类所需要的，从其他方法又难以大量获得的重组蛋白质。 1、第一个用细菌表达的用于人类的基因重组药物——人胰岛素上市（ 1979年美国基因技术公司） 3、生物钢 理论意义 1、彻底填平了生物种属间不可逾越的鸿沟 2、重组技术缩短了进化单位 3、能按人们的意愿定向改造、培育新品种 4、解决医学与生物学上长期无法解决的许多重大（如是什么基因、在什么地方、什么时间、起什么作用？如何起作用？） 　　　人们预言，21世纪是生命科学的世纪，以基因工程为主导的生物技术可能对世界的重大问题－－饥饿、疾病、能源、污染等提出切实的解决办法，推动社会生产力的飞速发展。 一、分子克隆中常用的工具酶 在重组DNA与基因工程中，对目的基因的分离、剪切和重组涉及到一系列酶催化反应，这些酶就像外科医生的手术刀一样，是进行基因工程操作必不可少的工具。常分为限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）、连接酶（ligase）和核酸修饰酶（modifying enzyme）。 限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶是指能识别DNA的特殊序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类酶。 它主要来源于原核生物，可将侵入宿主细胞的外源性DNA迅速降解，而对细菌自身的DNA，则通过甲基化酶在该种限制酶切位点甲基化修饰而保护自身的DNA不被降解。 限制性内切酶由于能限制外源DNA的“入侵”而得名。 限制性核酸内切酶的命名 命名是根据含有该酶的微生物种属而定。通常有三个斜体字母的缩写表示。 第一个大写字母取自细菌属名的第一个字母； 第二、三个小写字母取自微生物种名的头两个字母；第四个字母代表该微生物同种内不同的株系；如果同一株名发现几种限制酶，