和细胞核DNA相比.docVIP

　与细胞核DNA相比，mtDNA作为生物体种系发生的“分子钟”(molecular clock)有其自身的优点：突变率高，是核DNA的10倍左右，因此即使是在近期内趋异的物种之间也会很快地积累大量的核苷酸置换，可以进行比较分析；因为精子的细胞质极少，子代的mtDNA基本上都是来自卵细胞，所以mtDNA是母性遗传(maternal inheritance)，且不发生DNA重组，因此，具有相同mtDNA序列的个体必定是来自一位共同的雌性祖先。但是，近年来PCR技术证实，精子也会对受精卵提供一些mtDNA，这是造成线粒体DNA异序性(heteroplasmy)的原因之一。一个个体生成时，该个体细胞质内mtDNA的序列都是相同的，这是mtDNA的同序性(homoplasmy)；当细胞质里mtDNA的序列有差别时，就是mtDNA的异序性。异序性对于种系发生的分析研究会造成一些困难。 　　在分子进化研究中，mtDNA同样也是十分有用的材料。由于线粒体基因在细胞减数分裂期间不发生重排，而且点突变率高，所以有利于检查出在较短时期内基因发生的变化，有利于比较不同物种的相同基因之间的差别，确定这些物种在进化上的亲缘关系。有人曾从一具4 000年前的人体木乃伊分离出残存的DNA片段，平均大小仅为90 bp。这对于核基因组来说，这么短的DNA片段很难说明什么问题，可是这是线粒体基因组DNA，就可能是某个基因的一个片段，可以进行比较分析。因此，当前的分子进化生物学的研究，多半是取材于古生物或化石的牙髓或骨髓腔中残留的线粒体DNA作为实验材料。 　　线粒体基因组中的基因与线粒体的氧化磷酸化作用密切相关，因此关系到细胞内的能量供应。近年来发现人的一些神经肌肉变性疾病如Leber氏遗传性视神经病(主要表现为双侧视神经萎缩引起急性或亚急性视力丧失，还可伴有神经、心血管及骨骼肌等系统异常)、帕金森病、早老痴呆症、线粒体脑肌病、母系遗传的糖尿病和耳聋等，都同线粒体基因有关。也有人指出，衰老可能同mtDNA损伤的积累有关。线粒体内的DNA，可参与蛋白质的合成，转录，与复制。特点是突变率高，母系遗传。具有较高的研究价值 与常规PCR相比，RAPD主要有以下的自身特点：无需专门设计RAPD扩增反应的引物，也无需预知被研究的生物基因组核苷酸顺序，引物是随机合成或是任意选定的。引物长度一般为9～10个寡核苷酸。每个RAPD反应中，仅加单个引物，通过引物和模板DNA链随机配对实现扩增，扩增没有特异性。退火温度较低，一般为36，这能保证短核苷酸引物与模板的稳定配对，同时也允许了适当的错误配对，以扩大引物在基因组DNA中配对的随机性。较之常规PCR，RAPD反应易于程序化。利用一套随机引物，得到大量DNA分子标记，可以借助计算机进行系统分析。 ??RAPD 作为单引物的PCR扩增产物，其产生机理是引物首先结合到模板链，沿模板5’端方向延伸而产生不同长度的DNA片段，然后以这些片段为模板继续大量扩增。 由于RAPD反应中，在3’端没有相应引物和模板互补，这样必然存在一个由引物沿模板DNA?5’端方向延伸后再在3’端形成同一引物互补序列的过程。有 人提出，在RAPD反应过程中，扩增可能存在一些这样的分子模式：5’端带有引物的单链DNA分子在3’端发生折转、自身结合和延伸，并在3’端形成同一引物的互补序列，变性展开后即可成为单引物PCR扩增的模板分子。通过两条5’端各带同一引物的单链DNA分子拼联来实现。对基因组DNA 分子的颠倒重复序列而言，如果引物的结合位置正好处于这些序列的3’端，那么在其DNA片段的两条单链上就分别具有一个引物的结合位置和它互补的序列，成 了RAPD扩增的模板分子。在双引物通用PCR中这种情况很少，但由于RAPD所用引物短，又在低温下退火，这增加了引物和颠倒重复序列结合的机会，完全 有可能产生RAPD。RAPD技术是建立在PCR技术的基础上，它用一系列(通常数百个)不同的随机排列碱基序列的寡核苷酸单链(一般为10个bp)作为引物，对所研究的基因组DNA进行单引物扩增。模板DNA经90—94变性 解链后在较低温度(36～37℃)下退火，这时形成的单链模板会有许多位点与引物互补配对，在 72℃下，通过链延伸，形成双链结构，完成DNA合成。重复上述过程，即可产生片段大小不等的扩增产物，通过电泳分离和显色便可得到许多不同的条带，从中 筛选出特征性条带。扩增产物片段的多态性反映了基因组DNA的多态性。如果基因组在这些区域内发生DNA片段插入、缺失或碱基突变就可能导致这些特定结合 位点的分布发生相应的变化，而使PCR产物增加、缺少或发生分子量的改变。因此，通过对PCR产物的检测即可测出基因组DNA在这些区域的多态性。进行 RAPD分析时，可用引物的数量很