人SRY基因表达与表达蛋白的结合功能研究.docVIP

人SRY基因表达及表达蛋白的结合功能研究 院系：生命科学学院 专业：生物工程 班级：122 学号：2012031202 姓名：陈志强 日期：2015年6月28日 【摘要】　　研究人类性别决定基因(sex determining region on the Y chromosome,SRY)表达蛋白对下游基因的调节作用。将SRY基因HMG结构域片段与表达载体PET-15b-进行重组，构建了SRY基因的表达质粒PETSY，转入大肠杆菌中表达，组氨酸结合树脂柱纯化表达蛋白，与苗勒氏管抑制因子基因(Müllerian inhibiting substance,MIS)启动子区片段进行凝胶电泳阻滞试验及竞争试验。获得SRY基因表达蛋白，分子量接近20.8U(21kD)，凝胶电泳阻滞试验及竞争试验表明，SRY表达蛋白能特异结合位于19号染色体的MIS基因的启动子区。提示SRY基因对MIS基因转录具有调节作用。 【关键词】　性别决定基因　　基因表达　　苗勒氏管抑制因子基因　　蛋白结合功能 前言 SRY基因作为睾丸决定因子(testis determining factor,TDF)的候选基因于1990年被Goodfellow定位在Y染色体短臂上之后，各种性别发育异常与SRY基因突变、缺失、异位等的研究相继报道。而SRY基因在性别发育过程中是如何起作用的，一直是人们关注的课题。目前认为SRY基因是在睾丸分化发育中起着开关式的重要调节作用的基因之一，其编码的蛋白具有DNA结合功能，属HMG结构域的转录因子家族。Haqq等［1］对SRY基因表达蛋白功能进行研究的结果提示SRY蛋白在调节下游基因中起重要作用。MIS是在性别发育过程中通过抑制苗勒氏管的发育而起作用的。为了研究SRY基因如何发挥DNA识别及转录调控的作用，以便进一步研究SRY基因的功能，我们利用基因工程技术构建了人SRY基因HMG结构域高效表达质粒，进行了蛋白表达与纯化，并对SRY基因蛋白表达产物与MIS基因启动子区的结合功能进行了研究。 1　材料与方法 1.1　材料1.1.1　菌种与质粒　质粒pSY-1为本室构建［2］，含有正常中国人SRY基因HMG结构域片段，表达质粒pET-15b及大肠杆菌BL21(DE3)pLys由我所北京市感染与免疫中心实验室提供，我室扩增制备。1.1.2　试剂TaqDNA聚合酶、限制性核酸内切酶、Klenow大片段酶、T4连接酶、Bam H　Ⅰ连接子、IPTG和Taq Track序列分析试剂盒等购自Promega公司、GIBCO-BRL公司及上海生工生物工程公司。组氨酸结合树脂柱为Novagen公司产品。［α-32P］-dATP购自亚辉生物工程公司，常规试剂均为国内有关厂家分析纯产品。1.2　方法1.2.1　构建表达质粒的策略　表达质粒的构建策略简述为：用E.coRI将pSY-1质粒切开，用Klenow大片段酶补齐后，连Bam H　Ⅰ连接头，再用Bam H　Ⅰ消化后即得到两端均为Bam H　Ⅰ切点的SRY基因片段。将此片段与经Bam H　Ⅰ线性化的pET-15b表达载体进行重组。表达质粒构建过程中的酶切、连接、转化及质粒提取、鉴定等步骤均按“分子克隆”［3］所述方法进行。1.2.2　SRY基因片段表达质粒的核苷酸序列分析　分别用引物S1和S2［4］从插入片段两端按照双脱氧末端终止法用Taq Track Sequencing System进行双链核苷酸序列分析。1.2.3　SRY基因片段的表达与纯化　将重组的人SRY基因片段的表达质粒转化至大肠杆菌BL21中，用0.4mmol/L的IPTC诱导后，经超声破菌，用组氨酸结合树脂柱纯化，经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)分析。1.2.4　MIS启动子区片段扩增及同位素标记　根据文献［5］设计MIS 启动子区片段扩增引物，P1：5′-CA-CATCAGGCCCAGCTCTAT-3′； P2：5′-TGGGTGC-TGCCAGGGG-3′。PCR反应液中含1.5mmol/L MgCl2,0.1mmol/L dNTP，0.1μmol/L引物。扩增程序为：94℃变性20秒，60℃退火20秒，72℃延伸30秒，共35个循环。PCR产物经1.4%琼脂糖凝胶电泳显示210bp的清晰带。按本实验室建立的方法［6］对其进行双链PCR产物直接测序。结果证实MIS启动子区序列与文献报道相符。将PCR产物用Klenow大片段酶补齐，连接Bam H　Ⅰ连接子。用Bam H　Ⅰ酶切后再用Klenow大片段酶对MIS片段进行［α-32P］dATP标记。1.2.5　凝胶电泳阻滞试验　参照文献［7］进行，用0.25×TBE制备4%的聚丙烯酰胺凝胶，250V预电泳1小时。蛋白结合试验在下列缓冲液中进行∶10mmol/L Tris