UV处理筛选耐高浓度乙醇酿酒酵母菌株.docVIP

《UV处理筛选耐高浓度乙醇酿酒酵母菌株》 诱变方法： 预处理：将诱变所需的仪器设备在无菌操作台上灭菌，紫外灯预热30min，将磁力搅拌器的电压调至4V，将制备好的菌悬液倒入含有磁珠的平皿中，开启磁力搅拌器的电源开关，待菌体均匀混合后，开始诱变。 诱变：将菌悬液用一次性塑料针管吸取5ml于编号的试管中，将紫外灯对准平皿的同时开始记时，每10s取一次样于对应试管中，直至90s停止照射，则得到10种菌悬液。 后处理：将诱变之后的菌悬液依次稀释10倍、100倍，再进行涂布，每次2滴（约0.1ml）即可，再将未做稀释处理的诱变菌株的10种菌悬液依次涂布，再重复一次，10倍、100倍也做同样处理，共60个培养皿，涂好后，放入暗箱（防止光复活）培养箱于25℃培养24h。 分析方法： 酵母生长的测定：测生长量，包括称干重法、比浊法、测含氮量法等。 记繁殖数，包括计数板法、菌落计数法等 酵母死亡率的测定： 耐酒精酵母筛选方法： 灭菌麦芽汁→冷却为40℃左右→加入无水乙醇，配成浓度分别为4%vol、6%vol、8%vol、10%vol、11%vol、12%vol、14%vol→紫外照射后的平板→挑取大且光滑的单菌落→接种待测酵母菌→25℃培养24h→观察产气情况→记录结果→分离纯化测定时的菌种→保藏菌种→ 挑取单菌落→接种针点于TTC下层平板→30℃恒温培养24h→倒TTC上层平板→30℃恒温培养3h→找出TTC上层平板上变红的菌落（候选的突变体）→转接于固体斜面→30℃恒温培养24h→菌落形态观察与鉴定→显微形态的观察→挑出变红（深色）的单菌落→接种于麦芽汁培养基中→扩大培养→分离纯化菌种→不同温度条件下发酵7d→每隔24h测其pH值、酸度，待发酵结束时测酒精度、耗糖率和总酸度。 镜检方法： 用胶头滴管吸取摇匀的菌悬液滴到载玻片上，盖上盖玻片，先用低倍镜观察，待视野清晰之后换高倍镜观察，一般40倍物镜即可，若菌体较密集，则将菌悬液适当稀释，直至稀释度适合为止。 麦芽汁发酵法：初筛选出的菌株活化后，接入麦芽汁培养基中扩大培养酵母菌，使活菌浓度为1.6×10个/ml，然后取 5ml接入装有150ml麦芽汁的锥形瓶中，30℃培养7d，每天对发酵液进行分析（可溶性固形物、糖度、酒精度、pH值和酸度）。复筛出性状最为优良的诱变菌株。 二氧化碳失重的测量：减重法取5ml装入150ml的锥形瓶中装入150ml麦芽汁，适宜温度条件下培养7d，每天称重，同样取5ml于100ml锥形瓶中记录每天失重情况，待发酵结束时称总失重。 仪器：SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台、立式高压蒸气灭菌锅、精密酸度计、智能型生化培养箱、恒温培养摇床、光学显微镜、旋转蒸发仪、数码相机、CJ-1磁力搅拌器、ZF-5手提式紫外灯。 要用到10个试管、60个培养皿、10个锥形瓶、3个烧杯和其他器皿若干。 《利用广谱性和特异性组合诱变技术选育辅酶Q10高产菌》 诱变方法 （1）诱变处理　　接一环出发菌于种子培养基中,摇瓶培养24 h,取5 ml培养液于10 000 r/min离心5 min收集菌体,用0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH= 6. 5)离心洗涤菌体2次,制成n=10ml菌悬液. (1) UV照射:取10 ml的10ml菌悬液至无菌平皿内,置于波长253. 7 nm,功率30W的紫外灯下30 cm处,开盖振荡分别照射5 s, 10 s, 20 s, 30 s和40 s. (2) NTG处理:取10 ml的10ml菌悬液,加入配置好的NTG溶液,使NTG的终浓度为500 mg /L,分别处理10 min、20 min、30 min、40 min和50 min后,用0. 1 mol/LpH 6. 5磷酸缓冲液洗涤离心细胞3次. (3) UV射线和NTG复合诱变:取10 ml的10ml菌悬液至无菌平皿内,UV照射5 s后加入NTG,使其最终浓度分别为200 mg /L、300 mg /L和400 mg /L,处理20 min后用0.1 mol/L pH= 6.5磷酸缓冲液离心洗涤细胞3次. （2）平板筛选　　抗性突变株的获得:取诱变处理的菌液接入种子培养基中,后培养12 h后,离心洗涤3次,稀释后直接涂布于细菌基本培养基平板上,然后在平板中间加入一定量的抗性物质如Eth、ActD、V, 30℃培养4~5 d,会出现明显的抑菌圈,在抑菌圈内挑选生长良好的单菌落即抗性突变株. X-gal利用能力提高的突变株的筛选:后培养的菌液稀释后直接涂布于X-gal平板上,培养2~3 d.出发菌株的菌落为淡蓝色,挑出呈深蓝色的菌落,即为X-gal突变株. （3）摇瓶筛选　　将平板筛选获得的突变株接入种子培养基,装液量为50ml/250ml三角瓶, 30℃, 200 r/min振荡培养24 h.取种子