重要肠道病原菌多重PCR基因芯片检测方法的研究.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００９，２９（１２）：７９～８４ 重要肠道病原菌多重ＰＣＲ基因芯片检测方法研究 尤元海　曾　浔　过　玮　尹　焱　张茂俊　张建中 （中国疾病预防控制中心传染病预防控制所传染病诊断室　北京　１０２２０６） 摘要　目的：建立并初步评价一种针对重要肠道病原菌的多重ＰＣＲ基因芯片检测方法。方法：对筛选 出的特异引物进行多重ＰＣＲ优化，将引物分别按种属内混合和种属间混合的方案排查引物间的竞争性 抑制现象，再将不同菌属的模板混合，用相对应的混合引物扩增，探寻高效特异的引物组合。分别掺入 和不掺入荧光素，验证其对混合ＰＣＲ反应的影响，并与芯片杂交，探寻多重ＰＣＲ扩增效率对芯片杂交 的影响。分析不同数量引物组合产生的杂交结果，筛选出无交叉反应的最优引物组合。结果：种属内 引物混合均得到特异性扩增结果。种属间混合霍乱弧菌和空肠弯曲菌得到部分预期条带，随着混合引 物数量的增加，交叉抑制现象也增多。杂交信号强度随多重ＰＣＲ扩增效率的增加而增强。反应中掺入 荧光素的扩增条带产量低于无荧光素的产物。可将３５对混合引物拆成３个体系分别标记样品，以避免 假阴性结果。结论：ＰＣＲ反应中掺入荧光素降低扩增效率和杂交效率，但并不影响对杂交结果的判读 和数据分析。基因芯片杂交信号强度取决于多重ＰＣＲ的扩增效率。肠道病原菌多重ＰＣＲ基因芯片检 测方法具有较高的特异性，混合ＰＣＲ可以分别按照种属内和种属间的引物组合方案用于多病原的筛 检。该基因芯片检测可以采用３个引物体系完成样品标记。 关键词　肠道病原菌　多重ＰＣＲ　基因芯片 中图分类号　Ｑ８１９ 　　感染性腹泻在我国发病率居各类传染病之首，长 的特异性，并以１７对混合引物ＰＣＲ初步评价了反应体 期以来严重危害人民健康。其中绝大部分由细菌引 系掺入荧光素对扩增效率和基因芯片杂交效率的影 ［１］ 响，为传染病诊断芯片的靶基因标记提供合适的反应 起，具有发病急、传播快等特点 ，对其进行快速诊断 以确定传染源是传染病防制工作面临的首要问题。目 条件，为提高芯片检测通量，将引物数量增至３５对，并 前在我国基层疾控单位大多沿用以分离培养生化鉴定 对扩增中引物间的交叉反应进行评价，通过杂交结果 为主的传统检测方法，繁琐耗时，已不能满足复杂多变 筛选出合适的引物组合，从而建立起一套快速、灵敏、 的疫情处理工作。免疫学方法和细菌快速鉴定仪的使 高通量、低成本、易于在基层单位推广使用的多重ＰＣＲ 用在一定程度上缓解了这一情况，但由于缺乏特异性 基因芯片检测方法。 高质量好的诊断血清，而且受诊断菌种数量和通量的 １　材料与方法 限制，仍不能进行快速准确的诊断。 　　针对这些问题，本研究采用多重ＰＣＲ方法对重要 １．１　材　料 的肠道病原菌包括致病性大肠（ＥＨＥＣ，ＥＴＥＣ，ＥＰＥＣ， １．１．１　菌株　致病性大肠杆菌、沙门氏菌、小肠结肠 ＥＩＥＣ，ＥａｇｇＥＣ）、霍乱弧菌、副溶血弧菌、沙门氏菌、空肠 炎耶尔森菌、志贺氏菌、李斯特氏菌、霍乱弧菌、副溶血 弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森菌、志贺氏菌、李斯特氏菌 弧菌由本所腹泻病室提供，空肠弯曲菌由河北医科大 等的多个毒力基因进行扩增，评价了各菌属多重ＰＣＲ 学第二附属医院神经内科提供。 １．１．２　主要试剂　ＴａｑＤＮＡ聚合酶购于华美生物工 收稿日期：２００９０５１４　　修回日期：２００９１０１９ 程公司， 科技部社会公益项目（２００４ＤＩＢ２Ｊ０６５）资助项目 ＣｙｄＵＴＰ购于ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｍａｃｉａ公司，引物 ５ 通讯作者，电子信箱：ｚｈ