ALV-J+gp85基因重组蛋白免疫佐剂联合接种雏鸡诱导免疫保护作用及研究.pdfVIP

ALv-J gp85基因重组蛋白与免疫佐剂联合接种雏鸡诱导免疫保护作用研究木 窦文文‘，李宏梅’，刘海港，成子强，刘建柱，井维芳，崔治中，郭慧君” (山东省生物工程-9疫病防治重点实验室，山东农业大学动物科技学院，山东泰安，271018) 摘要：【目的】探讨使用ALV-J囊膜蛋白基因gp85原核表达产物联合不同免疫佐剂及使用不同免疫次数诱导雏鸡产生保 经诱导后得到目的基因的重组蛋白，纯化后作为免疫蛋白；并用弗氏佐剂和CpG佐剂联合接种7日龄雏鸡，接种后第3周部 分鸡只进行二次免疫接种，第8周进行攻毒试验，攻毒后观察3周。试验期间每周取血清检测ALV-J抗体，攻毒后检测ALV-J 病毒血症和致病性，使用IFA检测脾脏组织的ALV-J分布。【结果】经原核表达的蛋白能够特异性结合ALV—J的单克隆抗体， 天)，二次免疫可增强这种免疫效果，产生高效价抗体维持在70天以上。蛋白免疫组可减少病毒血症产生免疫保护率为33．3％， 基因原核表达蛋白的免疫原性，产生较好免疫保护作用，二次免疫可增强首次免疫后抗体反应和免疫保护作用。本研究为开 发有效地ALV—J亚单位疫苗提供科学依据。 关键词：ALV-J；原核表达；弗氏佐剂；CpG；免疫保护 刖昌 leucosisvirusof J亚群禽白血病病毒(avian subgroupJ，ALV—J)是上个世纪九十年代发现的一 种新型白血病病毒，最早是从肉鸡中分离鉴定的。它的靶细胞为骨髓细胞，引起骨髓细胞瘤病Ⅲ。中国在 1999年首先有白羽肉鸡中ALV—J感染的报道并分离到病毒，并证明这一病毒感染在白羽肉鸡的父母代种鸡 群或商品代肉鸡的现象非常普遍幢。4。。近几年来，又进一步发现，ALV-J已传播到蛋用型鸡嵋刊及中国不同地 区的某地方品系中H吲。显然，ALV—J的感染已在中国鸡群中有了广泛的传播，如不采取相应的预防控制和 净化措施，势必会进一步给中国养鸡业带来更大损失。 为了控制和预防ALV—J在中国地方种鸡中的流行，需要对我国地方种鸡实施净化¨0|。由于我国种鸡品 系和种群数量大、饲养不规范和饲养密集等特点，可能需要较长时间的净化才能达到感染率非常低的防控 要求；此外，还需要借助其他的防治方法降低鸡群的ALV—J感染率，以达到加快净化的目的…1。使用疫苗 预防是一有效地可选择方法，但对ALV—J至今尚未有有效地疫苗在生产中加以应用。 并在大肠杆菌进行诱导表达，使用不同免疫佐剂和免疫程序对雏鸡进行免疫接种，获得效价较高的抗体， 对免疫鸡只进行攻毒后，对其免疫保护作用进行研究，为开发有效地ALV-J亚单位疫苗提供了科学依据。 1材料与方法 1．1 病毒、细胞及实验动物J亚群禽白血病病毒NX0101株由山东农业大学崔治中教授惠赠，病毒经复苏、 ml 增殖培养后每0．1 (CEF)。海兰褐1日龄雏鸡，购于泰安市东岳种禽场，试验前进行ALV感染检测，全部为阴性者进行动物 免疫接种试验。 基金项目：公益性行业(农业)科研专项经费资助(201203055) ·——409·—— 第四届中国兽药大会——兽医微生物学、兽医生物制品学学术论坛论文集(2012年) 1．2质粒载体与菌株克隆载体PMDl8一Tsimple 载体购于Invitrogen公司，大肠杆菌(E．coli)DH5 Q、BL21(DE3)菌株均由本实验室保存。 1．3试剂与药品限制性内切酶BamH DNA Mixture， I、HindIII，高保真聚合酶pyrobestpolymerase，dNTP Kit，DNAmark，Protein PrimeScript@RTreagent mark，IPTG均购于大连宝生物工程有限公司。胶回收 天根生物工程有限公司。免疫佐剂包括弗氏佐剂(F)和核酸佐剂CpG(C)，前者购置于北京博奥生物有限 公司：后者被设计后送宝生物工程(大连)有限公司合成。其他常规试剂均由本实验室提供。 1．4 ALV-J gp85蛋白免疫抗原的制备 1．4．1 性碱基，对J亚群gp85基因进行扩增。