大鼠抗子宫内膜抗体(EMAb)酶联免疫吸附测定.pdfVIP

大鼠抗子宫内膜抗体（EMAb）酶联免疫吸附测定 试剂盒使用说明书 本试剂盒仅供研究使用 预期应用 ELISA 法定量测定大鼠血清、血浆、细胞培养物上清或其它相关液体中抗子宫内膜抗体 （EMAb）含量。 实验原理 本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中抗子宫内膜抗体（EMAb）水平。用抗 原包被微孔板，制成固相，往包被单抗的微孔中依次加入抗子宫内膜抗体（EMAb）、生物 素化的抗大鼠抗子宫内膜抗体（EMAb）抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物 TMB 显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。 颜色的深浅和样品中的抗子宫内膜抗体（EMAb）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定 吸光度（OD 值），计算样品浓度。 试剂盒组成及试剂配制 1.酶联板：一块（96 孔） 2.标准品（冻干品）：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至 1ml，盖好后静置10 分钟以上， 然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为10000 pg/mL，做系列倍比稀释后，分别稀释成10000 pg/mL，5000 pg/mL ，2500 pg/mL，1250 pg/mL，625 pg/mL，312.5pg/mL，156 pg/mL，其 原液直接作为最高标准浓度，样品稀释液直接作为标准浓度0 pg/mL，临用前15 分钟内配 制。 如配制5000 pg/mL 标准品：取0.5ml 10000 pg/mL 的上述标准品加入含有0.5ml 样品稀释液 的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。 3.样品稀释液：1×20ml/瓶。 4.检测稀释液A：1×10ml/瓶。 5.检测稀释液B：1×10ml/瓶。 6.检测溶液A：1×120ul/瓶（1：100）临用前以检测稀释液A1：100 稀释，稀释前根据预先 计算好的每次实验所需的总量配制（每孔100ul），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如1ul 检测溶液A加99ul 检测稀释液A 的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。 7.检测溶液B：1×120ul/瓶（1：100）临用前以检测稀释液B1：100 稀释。稀释方法同检测 溶液A。 8.底物溶液：1×10ml/瓶。 9.浓洗涤液：1×30ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。 10. 终止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。 标本的采集及保存 1．细胞培养物上清：请离心后收集上清，并将标本保存于-20℃，且应避免反复冻融。 2．血清：标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000 xg 离心20 分钟，取上清即可检测， 或将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。 3．血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30 分钟内于2 -8° C1000 x g离心15 分钟，或将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。 注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。 操作步骤 各试剂在使用前平衡至室温。 1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。除空白孔外，余孔分别加标准溶液或待测样 品100ul，注意不要有气泡，轻轻混匀，酶标板加上盖，37℃反应120分钟。 2.弃去液体，甩干，不用洗涤。 3.每孔加检测溶液A工作液 100ul，37℃,60分钟。洗板3 次，350ul/每孔，甩干。 4.每孔加检测溶液B工作液 100ul，37℃，60 分钟，洗板5 次，甩干。 5. 依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光显色30 分钟（此时肉眼可见标准品的前3-4 孔有明 显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显）。 6.依序每孔加终止溶液50ul，终止反应（此时兰色立转黄色）。用酶联仪在450nm波长依序 测量各孔的光密度（OD 值）。 注： 1． 每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是最后加底物溶液及2NH2SO4。 测量时先用此孔调OD值至零。 2．为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内。 洗板方法 手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸， 酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.4ml 注入孔内，浸泡1-2 分钟，根据需 要，重复此过程数次。 自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。 特异性 本试剂盒可同时检测重组或天然的大鼠抗子宫内膜抗体（EMAb），且与其它相关蛋白无 交叉反应。 计算 以标准物的浓度为横坐标（对数坐标），OD 值为纵坐标（普通坐标），在半对数坐标纸上 绘出标准曲线，根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用