RNAi抑制HIF-1α表达对胃癌BGC-823细胞株上皮间质转化现象影响.pdfVIP

RNAi抑制HIF一1 Q表达对胃癌BGC一823细胞株 上皮间质转化现象的影响 张佐阳邹萍吴继锋 (安徽医科大学病理学教研室230032) 实体肿瘤快速生长时，肿瘤细胞微环境缺氧是其共同特征。在缺氧微环境下， induced 肿瘤细胞高表达缺氧诱导因子一1(hypoxiafactor，HIF)，促进肿瘤细胞 HIF由眦F—l 异质化及肿瘤血管生成，促进肿瘤细胞浸润转移【1lo Q及HIF一1B组 成的异源性二聚体，HI卜1Q是其活性调节亚单位Ⅲ。我们的前期研究发现，胃癌组 织中HIF一1Q的高表达与生物学行为及患者的生存率密切相关‘31，为了迸一步探讨 HIF一1 Q的表达在胃癌上皮间质转化现象过程中的作用，本实验设计合成RNA干扰 Q 质粒并导入胃癌细胞，采用细胞免疫荧光染色，检测胃癌细胞BGC一823中HIF一1 蛋白表达情况；采用Transwell小室检测细胞侵袭能力与缺氧微环境的关系，从而 为深入地了解上皮间质转化现象对胃癌细胞增殖、侵袭、转移的作用及调节机制打 下理论基础。 l、材料和方法： ％胰蛋白酶消化传代，取对数生长期细胞用于实验；仪器有PCR仪、荧光显微镜，倒 Pro—P1us 置显微镜、Image 2000、逆转录试剂盒、总蛋白提 基、胰蛋白酶、FBS、Trizol试剂、Lipofectamine 取试剂盒、Matrigel侵袭小室等。根据Genbank中报道的HIF．1 苷酸序列，参考siRNA设计原则针对HIF一1 行设计干扰片段，后送上海生工生物试剂公司合成。寡核苷酸两端分别带有B锄1HI和 HindⅢ酶切位点，序列如下： um01几CoCl：加入培养基体外化学模拟缺氧环境，作为阳性对 作为内参对照，以200 照组。 1．2方法： 的DMEM培养基常规培养和传代。按照Lipofectamine2000转染试剂盒说明书进行 空白对照组不加质 转染。阳性对照组在培养液中加入终浓度为200umol／Lcocl2， 粒，空质粒组使用空质粒。 1．2．2 Q RT—PCR检测细胞中HIF一1mRNA的表达：提取培养细胞总RNA，逆转录合 Q 成HIF—lcDNA第一链，PCR扩增30个循环，眦F一1Q引物序列：上游： in引物序列： 凝胶电泳鉴定PCR产物。 1．2．3细胞免疫荧光：转染细胞培养24小时后取出，PBS冲洗后用95％的乙醇固定30 分钟，按照说明书行细胞免疫荧光染色。 1．2．4统计学处理：应用SPSS13．O统计软件。组内比较采用单因素方差分析，组 间比较用LSD法检测各组与对照组之间差异。P≤0．05为差异有统计学意义。 2．结果 2．1psilencer3．卜HIF一1Q干扰重组体对HIF一1Q表达的抑制作用 Pro—P1us 经过R卜PCR后，应用凝胶成像仪成像，经软件Image 6．0显微 图像分析系统分析，采用相对表达量来半定量mRNA的表达。结果显示：与空白对 Q干扰重组质粒可以明显抑制HIF—l 照组和空质粒组相比，psilencer3．卜HIF—l Q Q