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不同纤维素培养基及温度对体外培养瘤胃 细菌多样性的影响 曾 燕1 孙朋1 倪学勤1’2+ 杨 杰1 曾 东1’2 张洪瑜1’2 (1．四川农业大学动物医学院，四川雅安625014； 2．动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川雅安625014) 摘 要 chajnreaction— 为探讨瘤胃细菌多样性，采用聚合酶链式反应一变性梯度凝胶电泳(Polymer髂e denaturinggmdientgel 成分分析，对牛体外厌氧条件下瘤胃细菌在cMc、Pcs、J、K培养基及37和50oc培养温度下的多样性进行 件下不同纤维素培养基和温度在一定程度上影响瘤胃细茵的多样性。 关键词PcR．DGGE；瘤胃细菌；纤维素；聚类分析；主成分分析(PcA) 将富含纤维素的秸秆开发为饲料将具有巨大的经济价值，添加微生物复合酶制剂可使秸秆饲料的利用 率大幅度的提高。纤维素是地球上含量丰富的碳水化合物，而位于植物细胞壁纤维素之间起抗压作用的木 质素却难以被微生物和酶降解。反刍动物瘤胃微生物能有效地将纤维素消化并作为自身重要的能量来源。 成年牛瘤胃中栖息着数量庞大的微生物，包括细菌、真菌、原虫和古菌，而细菌在分解纤维素的过程中发挥着 重要作用。因此，研究瘤胃纤维素分解细菌对提高反刍动物生产性能及开发秸秆饲料具有重要意义。 人们长期以来主要采用分离和培养的方法对瘤胃微生物菌群结构进行研究，不但费时费力且重复性差。 目前仅有11％左右的微生物种类通过纯培养技术被分离。近年来，国内外学者对瘤胃微生物进行了研究， 对其多样性和功能有了一定的认识，但对其中影响宿主代谢和生产性能的关键功能菌的分离、鉴定、作用模 式及其利用的研究仍处于初步阶段，许多占优势的细菌至今还未在实验室里被分离出来。PCR—DGGE技 术被广泛用于鉴定微生物种群及进行复杂微生物群落结构演替规律、微生物种群动态、基因定位和表达调控 的评价分析，能更加全面准确地反映复杂肠道微生物菌群多样性。本研究通过将瘤胃样品进行富集培养后 序，旨在为评估反刍动物瘤胃细菌在不同培养条件下的多样性及了解瘤胃细菌种类提供依据，更可为后续分 基金项目：教育部留学回国人员科研启动基金资助(200835一I)；四川省学术带头人培养基金资助 作者简介：曾燕，硕士研究生，E—mail：zengyanA@fbxmail．com。 +通讯作者：倪学勤，教授，博士生导师，主要从事动物微生态的研究，E—mail：xueqin面@foxmail．com。 已发表：《中国农业大学学报》2013，18(6)：148—152 离纤维素降解细菌时富集培养条件的选择提供参考。 1材料与方法 1．1 试验材料 1．1．1样品的采集 瘤胃内容物采自四川省雅安市飞机坝屠宰场。无菌采集3头牛瘤胃内容物各约20—30 g(标记为A、B、 C)，置一80℃冰箱保存备用。 1．1．2培养基 min。 无CMC—Na、微晶纤维素和纤维素粉)，121℃灭菌15 1．2瘤胃样品的富集培养 取瘤胃样品A、B、C各l mL培养基的三角瓶中，分别在37和50℃厌氧培养48h后摇匀分 g至装有30 mL 装于1．5 EP管中，置一20℃保存。 1．3细菌总DNA的提取 参照文献[15]提取细菌总DNA。用核酸浓度测定仪测定总DNA浓度后置一20℃保存备用。 16SrDNA 1．4基因组总DNA V，区扩增 参照文献[16]根据大肠杆菌16s CCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAG 的5’一CGC CAG 7一GTArITllACCGCGGCTGCTGGCA T一3’，下游引物为5 C一3’。PCR反应体系包括1．0止上游引