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氨基酸营养缺陷性的筛选与鉴定 ————芽孢杆菌 实验目的 1.学习营养缺陷型突变菌株的筛 选 2.掌握营养缺陷型的诱变以及筛 选鉴定 实验原理 芽孢杆菌  芽孢杆菌（Bacillaceae），细菌的一科，能形 成芽孢（内生孢子）的杆菌或球菌。包括芽孢杆 菌属、芽孢乳杆菌属、梭菌属、脱硫肠状菌属和 芽孢八叠球菌属等。它们对外界有害因子抵抗力 强，分布广，存在于土壤、水、空气以及动物肠 道等处。芽孢杆菌bacillus 杆菌科的一属细菌。 特性  1. 繁殖快速：代谢快、繁殖快，四小时增殖10 万倍，标准菌四小时仅可繁殖6倍。  2. 生命力强：无湿状态可耐低温－60℃、耐高 温+280℃，耐强酸、耐强碱、抗菌消毒、耐高 氧（嗜氧繁殖）、耐低氧（厌氧繁殖）。  3.体积大：体积比一般病源菌分子大四倍数， 占据空间优势，抑制有害菌的生长繁殖。 实验流程 诱变处理 淘汰野生型 营养缺陷型的检出 鉴定缺陷型 诱变方法 物理诱变 应用较多的是辐射诱变，即用α射线、β射线、γ射线、Χ射线、中子和其他 粒子、紫外辐射以及微波辐射等物理因素诱发变异 化学诱变 化学诱变除能引起基因突变外，还具有和辐射相类似的生物学效应，如引起 染色体断裂等，常用于处理迟发突变，并对某特定的基因或核酸有选择性作 用。化学诱变剂主要有：①烷化剂。这类物质含有1个或多个活跃的烷基，能 转移到电子密度较高的分子中去，置换其他分子中的氢原子而使碱基改变。 常用的有甲基磺酸乙酯(EMS）、乙烯亚胺（EI）、亚硝基乙基脲烷 （NEU）、亚硝基甲基脲烷（NMU）、硫酸二乙酯（DES）等。②核酸碱基 类似物。为一类与DNA碱基相类似的化合物。渗入DNA后，可使DNA复制发 生配对上的错误。常用的有5-溴尿嘧啶(BU）、5-溴去氧尿核苷（BudR）等。 ③抗生素。如重氮丝氨酸、丝裂毒素C等，具有破坏DNA和核酸的能力，从 而可造成染色体断裂。 淘汰野生型菌株的方法有  抗生素法：细菌用青霉素法：细菌细胞壁的主要成分为肽聚糖， 而青霉素能抑制细胞壁肽聚糖链之间的交链，阻止合成完整的细 胞壁。处在生长繁殖过程的细菌对青霉素十分敏感，因而被抑制 或杀死，但不能抑制或杀死处休止状态的细菌。将诱变处理后的 菌悬液分离加有抗生素的基本培养基上，培养后野生型细胞由于 正常生长繁殖而被杀死，营养缺陷型细胞因不能生长而被保留下 来，达到富集目的。酵母菌用制霉素法：制霉素作用于真菌细胞 膜上的甾醇，引起细胞膜的损伤，杀死生长繁殖过程的真菌，起 到富集营养缺陷型的作用。 高温杀菌法： 利用芽孢杆菌类的芽孢和营养体对热敏感性 的差异，让诱变后的细菌形成芽孢，然后把处在芽孢阶段的细菌 移到基本培养液中，振荡培养一定时间，野生型芽孢萌发，而营 养缺陷型芽孢不能萌发。此时将培养物加热到80℃，维持一定时 间，野生型细胞大部分被杀死，缺陷型则得以保留，起到了浓缩 作用。 菌丝过滤法： 真菌和放线菌等丝状菌的野生型孢子在基本 培养基中能萌发长成菌丝，而营养缺陷型的孢子则不能萌发。把 诱变处理后的孢子移入到基本培养液中，振荡培养10h左右，使 野生型孢子萌发的菌丝刚刚肉眼可见，用灭菌的脱脂棉、滤纸或 玻璃漏斗除去菌丝。继续培养，每隔3~4h过滤一次，重复3~4 次，最大限度地除去野生型细胞。然后稀释、涂皿分离。 营养缺陷型的检出  点植对照法法诱变后的孢子或菌体，经富集培养，涂布分 离在完全培养基平板进行培养，待菌落孢子成熟后，用灭菌 的牙签或接种针把每个菌落上孢子或菌体分别接到基本培养 基和完全培养基平板上的相应位置，同时培养，然后观察对 比菌落生长情况。如果基本培养基上不生长而完全培养基相 应位置上生长的菌落，可能为营养缺陷型。挑取孢子或菌体 分别移接到基本培养基和完全培养基斜面上，进一步复证。 该法可靠性强，但工作量大。 影印法经富集后的