碱裂解法提取质粒DNA.docVIP

碱法 　　1、取1.5ml培养液倒入1.5ml离心管中，4℃下12000g离心30秒。 　　2、弃上清，将管倒置于卫生纸上数分钟，使液体流尽。 　　3、菌体沉淀重悬浮于100μl溶液Ⅰ中（需剧烈振荡），室温下放置5-10分钟。 　　4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl，盖紧管口，快速温和颠倒离心管数次，以混匀内容物（千万不要振荡），冰浴5分钟。 　　5、加入150μl预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10秒，使沉淀混匀，冰浴中5-10分钟，4℃下12000g离心5-10分钟。 　　6、上清液移入干净离心管中，加入等体积的酚/氯仿（1:1），振荡混匀，4℃下12000g离心5分钟。 　　7、将水相移入干净离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，振荡混匀后置于-20℃冰箱中20分钟，然后4℃下12000g离心10分钟。 　　8、弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入1ml70％乙醇洗沉淀一次，4℃下12000g离心5-10分钟。 　　9、吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，真空干燥10分钟或室温干燥。 　　10、将沉淀溶于20μlTE缓冲液（pH8.0，含20μg/mlRNaseA）中，储于-20℃冰箱中。 　　[注意]1.提取过程应尽量保持低温。2.提取质粒DNA过程中除去蛋白很重要，采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好，要将蛋白尽量除干净需多次抽提。3.沉淀DNA通常使用冰乙醇，在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。沉淀DNA也可用异丙醇（一般使用等体积），且沉淀完全，速度快，但常把盐沉淀下来，所以多数还是用乙醇。