基于real-time+PCR平台的耐药基因点突变检测方法及研究进展.pdfVIP

基于real—time PCR平台的耐药基因点突变 检测方法的研究进展 邓春朋 王红宁’ 雷昌伟 张安云 (四川大学生命科学学院动物疫病防控与食品安全四川省重点实验室“985工程”西南资源环境 与灾害防治科技创新平台生物资源与生态环境教育部重点实验室，四川成都610064) 摘要 随着基因突变检测方法的发展，基于reaI—time PCR平台的方法被广泛地运用到耐药基因点 突变的检测中，尤其是荧光探针熔解度的方法，因其快速简便、灵敏度高、准确性高、特异性强，可根据探针熔 解度曲线的Tm值差异有效识别点突变等特点成为了目前比较流行的基因点突变检测方法。本文重点介绍 了近年来常用的一些基于real—time PCR平台的耐药基因点突变检测方法。例如，FRET探针熔解度分析法 分析法因更具快速简便和对仪器要求低的特点而广受关注。 关键词PCR；耐药基因；点突变检测方法 引 言 随着基因突变检测方法的发展，real—time PCR的方法被广泛用到耐药基因的检测中。基于real—time Green 不饱和染料，例如sYBR I，不但特异性差，对点突变的分辨率低，还会对反应体系有抑制作用，而影响 待检测的目的基因片段的溶解温度，因此不适用于基因点突变的检测。而荧光探针PcR法，用荧光探针替 代荧光染料，具有灵敏度高、准确性高、特异性强、快速简便，还可根据Tm值差异有效识别突变等特点被广 泛用于基因点突变的检测。因此成为了目前比较流行的基因点突变的PCR检测方法。 Resonance 常用的荧光探针PcR法有荧光共振能量转移(FluorescenceEnergy Resolution 度曲线分析法，高熔解度曲线分析法(High Melting，HRM)，分子信标(molecularbeacon)和Taq— Man探针熔解度曲线分析法等。 1 FRET探针熔解度曲线分析法 FRET探针又称双杂交探针，FRET探针由两条相邻探针组成，在一条探针的5’端标记FAM荧光基团， 业(农业)科研专项经费项目(201303044，201403054)，四川省科技支撑计划项目(2013Nz0025) 作者简介：邓春朋，男，硕士研究生，从事应用微生物研究，b蛐gbangdcp@163．com。 +通讯作者：王红宁，女，教授，博士生导师，从事动物疾病防控、微生物基因工程研究，whonglling@163．com。 四川省畜牧兽医学会2014年学术年会 另一探针的37端标记Red 针游离，两基团距离远，不能产生640波长的荧光。由于FRET探针是靠近发光，所以检测信号是实时信号， 非累积信号。因此可用来进行熔解度曲线分析，根据Tm值的差异达到检测点突变的目的。常用的荧光基 PCR仪。 2 高分辨率熔解曲线分析法(HRM) HRM是在实时荧光定量PcR基础上通过饱和染料(荧光染料EvaGreen或Lcgreen)监控核酸的熔解曲 线变化进行分析的一种新兴技术。HRM技术因其速度快，操作简便，高通量，灵敏性特异性高，可实现对单 碱基突变进行检测而广受欢迎。目前，这种技术因以下两个原因难以普及：一是对real—timePcR仪器要求 scannerreal—time scanner仪器的 高，(样品间的温度差异不超过0．1摄氏度)可在“ght PcR仪中进行。L培ht 升温速度每秒o．I度，每摄氏度可以采集100个数据点，可以密集的绘制出DNA分子的熔解曲线。二是需 要饱和染料。常用的饱和荧光染料是EvaGreen或LC Green