生物工程专业综合实验Ⅲ .ppt

生物工程专业综合实验Ⅲ 兰州理工大学 生命科学与食品工程实验教学中心 1.掌握活细胞的固定化方法；2.学习固定化酵母的酒精发酵及其性能测定方法，并进一步理解酒精发酵的原理。 采用物理或化学的方法固定微生物细胞，以微生物在固定化后的生长状态可分为3类：固定化死细胞、固定化活细胞和固定化增殖细胞。 四、操作步骤 四、操作步骤 * * 一、实验目的 固定在载体上、并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞称为固定化细胞。 固定化细胞的目的：不需多次培养、扩大，可以缩短发酵生产周期。 二、实验原理 最令人感兴趣的是固定化增殖细胞，因为多数微生物代谢的产物与其生长相关。 微生物细胞的固定化方法有： （1）吸附法， （2）包埋法， （3）不用载体法。 包埋法 包埋法 是制备固定化细胞最常用的方法。将生成菌株用包埋剂如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、琼脂、海藻酸、卡拉胶、醋酸纤维、胶原、明胶等包埋起来，发挥微生物的作用。 吸附法 最常用的是 物理吸附法：是将微生物细胞附着于固体载体上的一种固定方法。常用的载体为多孔砖、瓷杯、木屑、蔗渣、聚氯乙烯、硅藻土、玻璃纤维等。 例如：将酵母用聚氯乙烯或多孔砖固定化，每g载体可以固定80mg酵母；也可将固定化的酿酒酵母，装入反应柱，以生产乙醇，乙醇可达120g/L。 物理吸附法载体与微生物细胞间不起反应，吸附量大，但细胞极容易脱落而流失，有待于进一步改善。 无载体法 这是选择适当的条件，通过一定处理使酶固定在细胞内的一种方法。 如葡萄糖异构酶是一种胞内酶，将生物细胞加热至60℃，10min，其他酶失活，则该酶被固定在细胞内，所以又称加热固定化。 又如链霉菌细胞用柠檬酸处理使酶固定在细胞内，若再用壳聚糖处理，使之凝聚干燥即成固定化细胞。 本实验采用包埋的固定化方法，把酵母细胞悬浮在海藻酸钠溶液中，再滴加入CaCl2溶液，形成海藻酸钙凝胶小球，细胞包埋在凝胶的小孔中，制成固定化细胞。 学生也可以经查阅资料自行设计酵母细胞的固定化方法。 三、实验仪器、试剂 1. 酵母菌细胞：酒精活性干酵母，或新鲜的斜面酵母菌种。 2. 2.5%海藻酸钠溶液40mL（海藻酸钠比较难溶，配制时需在加热条件下溶解，并不断搅拌，使其成均匀的胶体溶液）；2 % CaCl2溶液100mL。 3. 培养基： ①增殖培养基：蔗糖 5%，蛋白胨 0.5%，7水硫酸镁0.1%，磷酸二氢钾 0.1%，调节pH5.0。（每组100mL装三角瓶，灭菌后备用） ②发酵培养基：蔗糖 15%，蛋白胨 0.5%，7水硫酸镁0.1%，磷酸二氢钾 0.1%，硫酸铵 0.2%，调节 pH5.0。（每组150mL装三角瓶，灭菌后备用） 1.干酵母活化：称取2g活性干酵母，投入50mL、2%蔗糖溶液中，在32℃条件下活化1~2h；然后离心弃去上清液（3000r/min、10min），备用。 2.固定化：将离心收集的酵母湿细胞悬浮在40mL海藻酸钠溶液中混合均匀。用注射器 （配11# 注射针头） 将海藻酸钠—酵母菌悬液点滴滴入CaCl2溶液中，形成球状颗粒；常温下静置2h，使其充分固化后滤出凝胶颗粒，用无菌水洗涤2~3遍，得到固定化细胞。 3.固定化酵母的增殖：将固定化颗粒投入增殖培养基中进行增殖（每50mL颗粒约加10的增殖培养基），120r/min、 30℃下增殖24h。定时测定酵母细胞数。 4.固定化酵母的批次酒精发酵：将增殖后的固定化酵母颗粒，置于150mL发酵培养基中、28℃进行酒精发酵。定时记录发酵液的糖度及酒精度的变化。