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本次实验课涉及的实验内容包括：实验十七：血清γ球蛋白的提纯，P96；以及实验八：醋酸纤维素薄膜电泳 本实验的目的是：掌握蛋白质提纯的方法及原理；了解蛋白质提纯的流程。 总体操作流程：（同时介绍时间安排，有利于学生安排自己的时间） 盐析20min 离心10min 层析 60min 显色反应10min 泡醋酸纤维素薄膜10min 午休 60min( 11: 40-12:40, 不同的组别不同的时间,提醒早来的同学看下午的实验步骤) 浓缩10min 点样 30min 电泳50min 看结果 15 min 先讲解盐析的操作 步骤 2ml兔血清+2mlPBS+2ml饱和(NH4)2SO4 强调最后加完血清的同学用蒸馏水将吸量管冲洗干净 强调(NH4)2SO4的加入应该是边加边震荡，几乎是加一滴震荡均匀，以免局部盐浓度过高或过低，沉淀的蛋白不全是γ球蛋白。 [原理一: 盐析 Salting Out Technique] 在大部分同学都做完了的时候讲 概念：（提问，然后再写板书） 在蛋白质溶液中加入大量的中性盐使蛋白质沉淀析出的方法（技术） 这个概念学生可以参考32页的内容，概念里讲述了用哪些盐，和盐析的原理 应用：（初步，粗）提纯蛋白质 原理(提问)： 1 蛋白质在水溶液中的稳定性因素？ 2 中性盐是否可以破坏这两个稳定性因素？ 盐的选择： 蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最多的硫酸铵，由下表可以看出：它的优点是温度系数小而溶解度大（20度时饱和溶液为754克/升；0度时饱和溶解度为706克/升），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间，当用其他pH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。 为什么选择(NH4)2SO4来做盐析？ 1 溶解度大，温度系数小 2 物美价廉 3 不使蛋白质变性 4 缺点：NH4+干扰双缩脲反应除-CO-NH-有双缩脲反应外，（-CONH2-）、（-CH2-）、（-NH2-）、（-CS-CS-NH2）等基团亦有此反应。可测定的范围为1～10mg蛋白质，适于精度要求不太高的蛋白质含量的测定，能测出的蛋白质含量须在约0.5mg以上。双缩脲法的缺点是精确度低、所需样品量大。干扰此测定的物质包括在性质上是氨基酸或肽的缓冲液，如TrIs缓冲液，因为它们产生阳性呈色反应，铜离子也容易被还原，有时出现红色沉淀。 盐析提纯蛋白质的其它条件 1 温度 2 pH : 所用盐溶液的pH与被提纯（或者说被沉淀的蛋白质）的pI应该有何关系？ 盐溶：salting in 在蛋白质水溶液中，加入少量的中性盐，如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等，会增加蛋白质分子表面的电荷，增强蛋白质分子与水分子的作用，从而使蛋白质在水溶液中的溶解度增大。这种现象称为盐溶。 盐析法提纯的抗原浓度不高，只用于抗原的初步纯化。 /view/329678.htm Ks分段盐析，β分段盐析 ???????????????????????? 盐析原理??? 一般是指溶液中加入无机盐类而使溶解的物质析出的过程。如：加浓（NH4）2SO4使蛋白质凝聚的过程。2 L! H% n( F7 a+ Z: _# q　　蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。 ????????????????????????? 盐析的优缺点) @9 n. d# }4 P2 z1. 成本低，不需要特别昂贵的设备。2. 操作简单、安全。3?3.不会引起蛋白质变性，经透析去盐后，能得到保持生物活性的纯化蛋白质。3 p4. 效果不理想，通常只是作为初步的分离纯化，还需要结合其它的纯化方法。 盐析实验步骤　　蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最多的硫酸铵，由下表可以看出：它的优点是温度系数小而溶解度大（20度时饱和溶液为754克/升；0度时饱和溶解度为706克/升），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间，当用其他pH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。) w3 L4 ~8 l: z, a) s???????饱和硫酸铵法# t( Z m3 B$ L+ M7 D6 L0 r( P3 J1. 取x ml血