菜花DNA的提取.pptVIP

一.实验原理 1．核酸分离提取的原则 1）应保证核酸一级结构的完整性 2）排除其他分子的污染 A． 核酸样品中不应存在对其有抑制作用的有机溶 剂和过高浓度的金属离子 B．其他生物大分子如：蛋白质，多糖和脂类分子 的污染应降低到最低程度 排除其他核酸分子的污染（如：提取DNA分子 应除去RNA；反之亦然） 2. 核酸提取的步骤 1）破碎细胞（材料不同，方法不同） 匀浆器，捣碎器，溶菌酶消化，碱裂解等。 2） 除杂质，提DNA 杂质：蛋白，多糖，脂类，RNA ，DNase A. DNase的抑制 DNase需Mg2+,Ca2+激活，所以提取时加0.01M EDTA或EDTA钠盐。（螯合金属离子） 加去垢剂或变性剂（SDS），可使DNase变性失活 B.? 除RNA 酶法：加RNase 调节pH：RNA能在室温条件下被稀碱水解成核甘酸而DNA对碱较稳定（核酸的理化性质），所以提DNA一般要在偏碱的环境中提取，提RNA要在偏酸的环境中稳定。 调节盐浓度(盐的分步沉淀)：在浓NaCl（1－2M）溶液中，DNA溶解度大，RNA溶解度小；在稀NaCl（0.14M）中，DNA溶解度小，RNA溶解度大，因此可利用不同浓度的NaCl溶液将DNA和RNA从样品中分开。 C. 除蛋白 加去垢剂或变性剂（SDS，十二烷基硫酸锂LDS，十二烷基肌酸钠，脱氧胆酸钠）使蛋白变性，与DNA分开； 用有机溶剂沉淀，除去蛋白 常用的有机溶剂：苯酚，氯仿，异丙醇，醚，8－羟喹咛，间甲酚等 本次实验所用：氯仿：异戊醇＝24：1 氯仿：使有机相和水相易分层，增加核酸得率，同时可除去脂类。 异戊醇：可减少泡沫，也能促使有机相，水相分离。 D. 除糖，脂类 对于含糖量高，含脂高的样品需要做 加蛋白水解酶：如提动物组织中的DNA，常加蛋白酶 K 二. 利用盐不同浓度提取DNA 1. 实验试剂和器材 1）材料 菜花 2）实验试剂 5mol/L NaCl溶液; 0.14mol/L NaCl-0.15mol/L EDTA-Na溶液; 25% SDS 溶液； 24:1 氯仿－异戊醇混合液；乙醇； 3） 实验器材 研钵 离心管:10ml指管 移液管， 高速离心机 水浴锅 三. 实验步骤 1.取菜花 4g，置研钵中，加少许石英沙仔细磨成糊状。 2.分次加入10ml 0.14mol/L NaCl-0.15mol/L EDTA溶液，将糊状物转入 两个10ml的离心管中。6000r/min离心10min，弃去上清。（注：做鸡肝的可再加7ml/管 0.14mol/L NaCl-0.15mol/L EDTA溶液，将沉淀搅匀后6000r/min离心8min，弃去上清）。所得沉淀为脱氧核糖核蛋白粗制品。 3.向上述沉淀物加入0.14mol/L NaCl-0.15mol/L EDTA溶液2ml/管，25％SDS溶液0.25ml/管,搅拌至混匀。置60℃水浴保温10min，取出冷至室温。此步操作系使核酸与蛋白质分离。 4.加入5mol/L NaCl 溶液1ml/管，搅拌混匀，加入约一倍体积的氯仿－异戊醇混合物（约4ml/管），颠倒混匀1－2min。 6000r/min离心10min。 5.吸出上清至洗净的研钵中，加入2倍体积的预冷95%乙醇，放置2-3分钟，DNA沉淀析出，用玻棒慢慢搅动，可将DNA丝状物缠在玻棒上。 6.将沉淀转入eppendorf管中,用无水乙醇洗涤一次,自然干燥,4 ℃保存备检测. 四.实验结果分析讨论 写出本次实验中提取DNA时每一步操作中所用试剂的目的。 查阅相关资料，写出至少一种其它方法提取DNA的原理及步骤 五. 琼脂糖凝胶法检测DNA 核酸检测方法 紫外吸收法 有机试剂法 琼脂糖凝胶电泳法 提取完好的DNA琼脂糖凝胶电泳图谱 未除去RNA的DNA琼脂糖凝胶电泳图谱