高分辨率熔解曲线小扩增子法结合混样法在线粒体13928GC突变分析中应用.pdfVIP

中国医药生物技术 2009 年 12 月第4 卷第 6 期 Chin Med Biotechnol, December 2009, Vol. 4, No. 6 445 DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2009.06.009 ·论著· 高分辨率熔解曲线小扩增子法结合混样法 在线粒体 13928G C 突变分析中的应用 张建佚，冯洁，杨泽，霍正浩 【摘要】 1.2 试剂和仪器 目的 探讨高分辨率熔解曲线（high resolution melting ， DNA 提取试剂盒购自美国 Promega 公司； HRM ）技术在线粒体 13928G C 突变分析中应用的可行性。 dNTP 购自美国 Pharmacia 公司；Taq DNA 聚合酶 方法 在 PCR 前，体系中加入饱和染料、高温寡核苷酸内 购自宝生物（大连）有限公司；LCGreen PLUS 饱 参（96 ℃）、低温寡核苷酸内参（60 ℃）和与待测样本等体 和荧光染料购自美国 Idaho 公司；石蜡油购自北京 积的已知基因型为 GG 的模板进行混样扩增，运用 HRM 鼎国生物技术有限责任公司。PTC-225 型 PCR 仪 技术对定量 DNA 的 PCR 产物进行基因分型，并从中随机 为美国 MJ Research 公司产品；Allegra TM 21R 离 抽取 20 例进行测序验证。 心机为美国 Beckman 公司产品；Lightscanner TM 结果 930 例样本中野生型 GG 占 728 例，突变型 CC HR-I 96 为美国 Idaho 公司产品；NanoDrop 占 202 例；DNA 定量有助于 HRM 分析时对分型结果的 ND-1000 核酸定量仪为为美国 Nanodrop 公司产 判断；同时联合运用高、低温内参比只用一种内参分型效果 品。引物合成及测序由上海生工生物技术开发有限 好；随机抽取的 20 例样本的测序结果与 HRM 分型结果 公司完成。 相一致。 1.3 方法 1.3.1 基因组 DNA 提取及定量 采取受试者 结论 运用高分辨率熔解曲线小扩增子法结合混样法可对 外周静脉血 500 µl ，2% EDTA 抗凝。用试剂盒提 线粒体基因组 13928G C 突变进行准确分型。 取 DNA ，通过核酸定量仪调整 DNA 的终浓度为 【关键词】 突变； 多态性，单核苷酸； 线粒体； 高 20 ~ 40 ng/µl 。PCR 前调整样本 DNA 终浓度至 分辨率熔解曲线 30 ng/µl 。 中国医药生物技术, 2009, 4(6):445-448 1.3.2 PCR 反应 引物设计 通过 Primer-5 软件完成，上 高分辨率熔解曲线（HRM ）技术自 2002 年应 游引物序列为 5’CCCACTATGCACATTTTATTTC 用于基因分型、突变扫描、序列匹配检测以来，受 TCC3’，下游引物序列为 5’AGATAGGGGATTGTG 到了高度重视并快速发展。应用高分辨率熔解曲线