链霉素耐药细菌的分离及鉴定.pdfVIP

学 术 论 坛 SCIENCE＆TECHN0LoGY 链霉素耐药细菌的分离及鉴定① 沈志华 潘子强’ 姚继枝 电子科技大学中山学院 广东中山 528400 摘 要 ：本实验对江和河道水源中链霉素耐药细茼的分离及鉴定，判断水体的链霉素污染情况。实验先通过含健霉素及不舍链霉素的 LB固体培养基培养，计数、筛选有耐药性的细茸，再采用连续梯度稀释法纯化，168 rDNA~增法进行分子鉴定 ，完成对耐药茵初步鉴 定。实验结论对预防和减缓水源耐药性细茵问题 ，为以后耐药性机制的研 究及寻找新型抗生素积累茸种资源有重要意义 。 关键词 ：链霉素 耐药细茵 分离鉴定 中图分类号 ：Q81 文献 标识码 ：A 文章编号 ：1672—3791 zo12 o6 a 一0249—03 链霉素 streptomycin 是一种氨基葡萄 抗菌药物情况下发生变异 ，从而获得耐药 机、PCR仪 PTC100，MJ公司 。 糖型抗生素 ，属于氨基糖甙碱性化合物，分 性 。这种耐药性 包括交叉耐药性、单向耐药 蛋白胨、酵母浸膏、链霉素 Genview 、 子式C，．H。NO 链霉素能与30S亚基结合 性和 多重耐药性 。细菌获得耐药性发生的 16SrDNA引物 F27、Rl492，上海英骏生物 并影响蛋 白质合成的多个环节从而起到杀 机制可分为遗传学机制和生化机制 。 技术有 限公司 、Taq酶 上海 申能博彩 等。 菌的作用。其结构为一分子链霉素胍和一 目前 由于大量地使用链霉素，导致链 分子链霉双糖胺结合而成的碱性苷 。链霉 霉素在一些食 品和生物体 中有残留。含链 2 方法 素为 白色无定形粉末 ，在酸性 条件下可以 霉素废水排入天然水体 中，是链霉素的存 2．1预处理培养皿、试管 移液枪枪头、过 水解成链霉胍和链霉双糖胺 ，进一步水解 在于 自然环境 中的关键原因。链霉素的残 滤器等的灭菌 可得到N一甲基一L一葡萄糖胺。在弱碱性情 留又是 导致耐药细 菌产生 的重 要原因 ，所 LB培养的配制 ；链霉素 1．6mg／mL 的 况下也可以水解得到链霉胍和链霉双糖 以必须对环境 、农产 品和食 品中链霉素残 配制 ；抗生素平板 的制备 ，将灭好菌的装有 胺 ，但进一步水解即将链霉糖部分重排为麦 留量进行检测 ，避免链霉素通过食物链在 50mLLB固体培养基 的三角瓶放入60℃水 芽酚 ，麦芽酚可以跟Fe”反应生成紫红色配 某一生物体 内积 累。 浴锅中，在水浴锅中保温半小时，使培养基 合物 ，这是链霉素的特有反应 ，可用于其鉴 的温度不超过50℃，然后取出三角瓶，加入 别，亦可用作含量测定。链霉素分子 中还有 1 材料和方法 链霉素 0．8mg／mL 225 L，摇匀，于无菌台上 醛基 ，可以被氧化剂氧化而降低抗菌活性 。 1．1材料 倒平板，每个平板所加的培养基约为15mL，平 细菌耐药性也称细菌抗药性 ，是指细 1．1．1耗材 板倒好冷却后 ，立即放入避光环境下。37℃ 菌能抵御抗生素影响的能力。细菌耐药性 离心管 1．5mL 、PCR扩增管 0．2mL 、 培养箱 中放置过夜 。 按传统的分类方法分为 固有耐药性和获得 枪头 10 L、200 L、lmL 、1．5mL离心管 2．2耐药性菌株的筛选 耐药性 。固有耐药性 也叫做天然耐药性 ，是 盒 、45mm过滤器、0．25 m滤膜等。 从Rl河流及R2河流中取得水样，取200 L 细菌对抗菌药 的天然不敏感 ，由于具有这 1．1．2仪 器和试剂 水样涂布在含抗生素 的平板上 ，另将原水 种特点的细菌不具有药物的作用靶点而产 移夜枪、pH计、培养箱、H1650电冰仪及 样稀释成10 和 10_，分别取l00 L涂布在 生耐药性 。获得耐药性是细菌在长期接触 电泳槽 北京六一仪器厂 、高速离心离心 不含抗生素 的平板上作对照 ，平衡涂布3个 表1R1及R2水耐链霉素细菌调查结果 平板 ，置于37℃培养箱 中培养24h。第二天 观察并计录单菌落数 ，同时计算细菌的耐 细菌菌落数 CFU／mL 耐药率 ％ 药率 。并从含抗生素平板上挑取菌落 比较 采样地点 采样次数 对照 0gg／mL 链霉素 10gg／mL 特殊的单菌落进行下一步的纯化鉴定 。 2．3耐药性细菌菌株的纯化及保藏 1 1．52±0．11 ×10 390±14 0．257 R1 对所挑取 的耐药性细菌菌株采用梯度 2 1．14±0．02 X10 l30土42 O．114 稀释法进行纯化 。用无菌的接种环将挑取 的单菌落接到含有0．5mLLB液体培养基的 3 1．31±0．02 ×10 l40±28 O．107 1．5mL离心管 中，振荡混匀后，