基因工程中常用三种工具酶.docVIP

一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease） 1．定义：凡能识别和切割双链DNA分子内特定核苷酸序列的酶，也称为限制酶（restriction enzyme，RE）。 2．类型：来自原核生物，有三种类型。 Ⅰ型：兼具甲基化修饰和ATP参与的核酸内切酶活性，随机切割。 Ⅱ型：大多能特异识别4～6个核苷酸序列（回文结构），最大识别序列为8个核苷酸，如SfiI、NotI；但有近10种Ⅱ型限制酶的识别序列为非回文结构，如SfaNI、MnlI等，Ⅱ型限制酶均可作为基因工程的工具酶。另有一些来源不同的限制酶的识别位点是相同的核苷酸序列，将这类酶特称为同工异源酶（isoschizomers）或同裂酶。同工异源酶切割产生相同的末端；有一些同工异源酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感性有所差别，故可用来研究DNA甲基化作用，如SmaI和XmaI；HpaII和MspI；MboI和Sau3AI是成对的同工异源酶；其中HpaII和MspI是一对同工异源酶，其识别位点是CCGG。与同工异源酶对应的一类限制酶，它们虽然来源各异，识别序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端，称为同尾酶（isocaudamers）。常用的限制酶BamHI、BclI、BglII、Sau3AI和XhoII就是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由GATC4个核苷酸组成的粘性末端。显而易见，由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的，因此在基因克隆实验中很有用处。但必须指出，由两种同尾酶消化产生的粘性末端，重组之后所形成的序列结构再不能被原来的任何一种同尾酶所识别。 Ⅲ型：功能基本同Ⅰ型，但为特定位点切割。 三种限制酶的区别如下表所示： Ⅰ型 Ⅱ型 Ⅲ型 DNA底物 dsDNA dsDNA dsDNA 辅助因子 Mg2+,ATP,SAM Mg2+ Mg2+,ATP 识别序列 特异 特异 特异 切割位点 非特定（于识别序列前后100~1000bp范围之内） 特定（切割于识别序列之中或近处，固定位点） 特定（切割点在识别序列后25~75bp处） 与甲基化作用的关系 内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用 酶蛋白不具有甲基化作用 内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用 3．命名：第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株。另外用罗马数字代表同一菌株中不同限制酶的编号，现在常用来表示发现的先后次序。如HindⅢ是来自Haemophilus influenzae D（嗜血流感杆菌D株第三种限制酶）。 4．切割位点和结果：限制酶位点在DNA链上是随机分布的，若识别位点为4bp，则44（256）个核苷酸可遇一个切点。若为6bp，则平均46（4096）个核苷酸才遇到一个切点。限制酶沿回文结构的对称轴切开，则产生平头末端（flush or blunt ends）如BalⅠ。多数限制酶错位切开dsDNA，产生5′ or 3′-单链互补顺序，称为5′ or 3′-粘性末端（sticky or cohesive ends），如HindⅢ、PstI。 5．反应条件： 限制酶酶切反应的影响因素如下： （1）DNA的纯度 限制酶消化DNA的反应效率，在很大程度上取决于所使用的DNA本身的纯度。提取DNA时，蛋白质、RNA、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、高盐等都有可能抑制限制酶的活性。小量制备的DNA尤其会遇到这种问题。RNA一般不影响酶的反应速度，但它能和蛋白质发生非特异性结合，从而减少酶的有效浓度。 少量蛋白质污染不影响酶活性，但如果是Dnase污染则会导致DNA的降解，它可能来源于溶解DNA的试剂溶液或者酶解缓冲液的组分。由于Dnase的活性需要有Mg2+的存在，而在DNA的储存缓冲液中含有二价金属离子螯合剂EDTA，一般用1mmol/L EDTA溶液（TE）溶解DNA，在保存DNA的过程中因为是低温，Dnase不会有活性，一旦将DNA加入反应体系，EDTA的浓度降低，在37℃温度下反应时，Dnase的活性就会发挥出来。混杂的结合蛋白则与DNA结合，不仅会封闭酶的识别序列影响酶解，而且形成的DNA—蛋白复合物将干扰DNA的电泳行为。要避免发生这种情况，唯一的办法就是使用高纯度的DNA。为了提高限制酶对低纯度DNA的反应效率，一般采用如下4种措施： ①增加限制酶的用量，平均每微克底物DNA可高达10单位甚至更多。 ②增加酶反应体系的体积，以使潜在的抑制物被相应的稀释。 ③延长酶解反应的保温时间。 ④向反应体系中添加亚精胺（spermidine）（终浓度为1~2.5mmol/L），亚精胺与负电性的杂质结合。注意，亚精胺在4℃时会沉淀DNA，因此