散发性大肠癌hMLH1与APEX基因多个单核苷酸多态性的检测及意义.docVIP

散发性大肠癌hMLH1和APEX基因多个单核苷酸多态性的检测及意义 　　作者：李静 陈丽 肖琳 安鼎伟 李迎杰 作者单位：辽宁医学院附属第一医院消化科，辽宁 锦州 121000 　　【摘要】目的 探讨hMLH1 T1151A和APEX A1247G，APEX T2197G多个单核苷酸多态性与散发性大肠癌的关系。方法 选取散发性大肠癌患者100例，并以100例正常人为对照。基因组DNA分别由大肠癌患者的癌组织中及健康人的外周血白细胞中提取，采用单链构象多态性分析结合基因序列分析，检测hMLH1 T1151A和APEX A1247G、APEX T2197G的多态性。结果 hMLH1 T1151A的多态性在正常人中发生率1.0%，在散发性大肠癌组中发生率11.0%，差异有显著性(Χ2=4.48，P0.05);APEX A1247G的多态性在正常人中发生率1.0%，在散发性大肠癌组中发生率13.0%，差异有显著性(Χ2=4.84，P0.05);APEX T2197G的多态性在正常人中发生率3.0%，在散发性大肠癌组中发生率27.0%，差异有显著性(Χ2=9.44，P0.01)。关联性分析显示hMLH1 T1151A和APEXA1247G无相关性，和APEXT2197G存在相关性;APEXA1247G和APEXT2197G存在相关性。结论 hMLH1 T1151A和APEX A1247G、APEX T2197G的多个单核苷酸多态性可能与散发性大肠癌的发生有关，可作为散发性大肠癌的筛查和预后监测指标。 　　【关键词】 大肠癌;单核苷酸多态性;APEX;hMLH1 　　大肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，也是众多肿瘤中遗传因素最突出的一种肿瘤。研究表明，单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，尤其是位于蛋白编码区的SNP和位于表达调控序列的SNP在功能和致病方面具有重要意义〔1〕。DNA修复能力的个体差异可能是决定肿瘤遗传易感性的极为重要的因素，一些DNA修复基因所具有的SNP可能导致氨基酸的改变从而影响其DNA修复活性〔2〕。hMLH1基因是错配修复基因，是细胞内修复系统的重要组成基因，它的突变导致基因功能的丧失是遗传性非息肉性大肠癌(HNPCC)发病的主要原因之一〔3〕。脱嘌呤/嘧啶核酸内切酶(APEX)是碱基切除修复过程中的限速酶，参与DNA损伤修复，与氧化还原有关，与凋亡相关〔4〕。本实验应用单链构向多态性分析(single strand conformation polymorphism，SSCP)及DNA测序法，对辽西地区散发性大肠癌患者hMLH1 和APEX基因的多个SNP进行联合检测，以探讨hMLH1 和APEX基因的多个SNP与大肠癌之间的关联，为大肠癌的筛查和预后监测提供指标。 　　1 材料与方法 　　1.1 病例资料 　　大肠癌患者均为2006年1月至2008年12月辽宁医学院附属第一医院普外科住院病例，男45例，女55例，年龄22～78岁，平均年龄(56.42±10.35)岁，家族中无大肠癌病人。术前均未经放化疗，术后病理证实为大肠癌。每个病例均取新鲜癌组织，-80℃保存，提取DNA待用。同时取100名健康志愿者的静脉血5 ml，提取DNA作对照。 　　1.2 方法 　　1.2.1 实验试剂 　　DNA提取试剂盒，DNA回收纯化试剂盒，Taq聚合酶等均购自上海Gentime公司，常规试剂由本院实验中心提供。引物由上海生工公司合成，DNA测序由大连宝生物公司完成。 　　1.2.2 基因组DNA 提取 　　采用DNA提取试剂盒提取癌组织和静脉血的基因组DNA。严格按说明书操作。DNA提取后用紫外分光光度计检测DNA 含量，A260/A280为1.65～2.0。DNA置-20℃冰箱保存。 　　1.2.3 PCR引物设计及反应条件 　　根据参考文献〔2〕设计3对引物,引物序列及扩增长度见表1。PCR反应体系25 Μl，Mix 12.5 Μl，双蒸水8.5 Μl，引物各1 Μl，模板2 Μl。反应条件：hMLH1：94℃预变性5 min;94℃ 40 s，55℃ 40 s，72℃ 1 min;72℃ 10 min;APEX：94℃预变性5 min;94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min;72℃ 10 min。表1 PCR扩增引物序列及扩增长度(略) 　　1.2.4 SSCP 　　取5 Μl PCR产物加5 Μl变性缓冲液，95℃变性10 min，后置于冰上10 min，将此混合物全部上样，行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳条件：电泳缓冲液1×TBE，电压