基因芯片技术与其在病原微生物研究中的应用(已修改).docVIP

基因芯片技术及其在病原微生物研究中的应用 基因芯片( Gene chip)是生物芯片的一种,也叫做DNA 芯片(DNA chip) 、DNA 微阵列(DNA microarray) ,所用的探针为寡核苷酸或互补DNA (cDNA) 。其原理来源于Ed Southern 提出的核酸杂交理论,传统的印迹杂交可以看作是其雏形。美国 Affymet rix 公司于20 世纪90 年代初率先开展了生物芯片技术的研究,Fodor 等(1991) 首次采用光导原位合成技术,经十步合成1024 肽的阵列,并与用荧光素标记的单克隆抗体相互作用,通过荧光显微镜检测反应结果。1995 年美国斯坦福大学研制成功了第一块以玻璃为载体的基因芯片。用高速机械手将cDNA 点样到预处理的玻璃上,以检测相应基因的表达量,由于芯片面积小而密度高,仅用2μl 的杂交体积即可检测来源于细胞的2μg 总mRNA ,应用双色荧光杂交检测到拟南芥( A ra2bi dopsis thal iana) 45 个基因的表达差异。自此以基因芯片为代表的生物芯片技术得到了迅猛发展,在生命科学领域发挥了重要作用,作为一个技术平台,已广泛应用于基因图谱绘制、基因表达谱分析、功能基因组学研究、疾病诊断、药物筛选、环境监测等多个领域。基因芯片技术是继大规模集成电路之后又一具有深远意义的科学技术革命。 一、基因芯片技术 基因芯片技术包括芯片的制备、待检样品的标记、杂交以及杂交结果的检测和分析。 1、基因芯片的制备 基因芯片的制备过程包括以下几个步骤：①探针的设计与合成；②芯片支撑物的处理；③DNA阵列点印；④芯片后处理，包括重新水合化及干燥、UV-交联、封闭及变性；⑤ 芯片质量检测。其中最关键的是DNA微阵列的点印，目前分为两种主要类型：原位合成（in situ syn-thesis）与合成后以微量点样技术点样。原位合成微型阵列采用阶梯式的方法在原位合成核酸。而微量点样技术，则是将少量经PCR扩增和纯化后的分子（如cDNA），用不同方法转移至芯片的指定位置上。另外，也出现了一些新方法，如Kimu-ra等用未经修饰的寡核苷酸探针与经碳二亚胺处理的玻璃表面，在紫外线的作用下结合，发现紫外线能使信号密度增加7倍，但并未改变信号分辨能力，单核苷酸多态性（SNPs）的配对/错配信号比也有提高。 2、待检样品的标记 待检生物样品一般需要通过扩增来增加检测灵敏度,在PCR 扩增过程中掺入荧光素或生物素来标记靶片断;如果待检样品是mRNA ,可以在反转录过程中进行标记,也可以在反转录之后再进行扩增、标记。 3、芯片杂交 属于固—液相杂交,与膜杂交相似。但对于不同类型的芯片和实验目的,杂交条件和杂交后的洗涤条件要求不同。对于寡核苷酸芯片,杂交条件需要严格加以控制,尤其是检测单点突变或单核苷酸多态性。一般的做法是在比探针的Tm 值低5～12 ℃条件下做预实验,再做相应调整。对于cDNA 微阵列,杂交条件的控制要求不如寡核苷酸芯片高。 4、杂交结果的检测和分析 待测样品多使用荧光标记,常用的荧光标记物为Cy3和Cy5 ,与之配套的检测设备有激光共聚焦系统(Confo2cal scanning devices) 和电偶联装置照相机(charged2cou2pled device cameras) 。对于cDNA 微阵列,信号的强度与样品中特定mRNA 的量呈正比,用相应的分析软件来分析量化的结果,可以发现某一条件下基因表达的差异。 二、基因芯片技术在病原微生物研究中的应用 1、在病毒研究中的应用 ⑴病毒基因的多态性　在感染性病毒中,有些由于其较高频率的突变,致使人们对其突变机制、致病机制及抗药机制的研究难度增加。将基因芯片用于此方面的研究可以充分发挥其高通量、高信息量的优势。 ⑵病毒的分型　我国是病毒性肝炎的高发区,目前病毒性肝炎的诊断停留在依次对甲、乙、丙、丁、戊等肝炎的筛查方法上,这会加重患者的负担。基因芯片是基于碱基互补的原理直接对病原体核酸进行检测,将来的诊断芯片有可能同时对所有肝炎病毒进行检测, 具有非常大的发展前景。 ⑶病毒感染对宿主细胞基因表达的影响　感染人巨细胞病毒HCMV 后,宿主细胞的基因表达水平有所改变,利用基因芯片可以检测到mRNA 的细微变化,利用基因芯片检测到的变化,有助于对病毒致病机理的进一步研究。 ⑷药物作用下病毒基因的表达情况　Chambers 等(1999)首次使用寡核苷酸芯片对人巨细胞病毒HC2MV 的当时几乎所有已知的开放阅读框进行药物作用下表达情况的检测，勾画出了HCMV