香烟烟雾对气道糖皮质激素受体和表达及粘液分泌影响及研究.pdfVIP

香烟烟雾对气道糖皮质激素受体的表达及 粘液分泌影响的研究 于旭华，吴蕾，胡涛，曾崎冈，刘厚强，林琳 广东省中医院，广东广州510120 摘要 目的探讨香烟烟雾及提取物对大鼠肺及A549细胞糖皮质激素受体及粘液分泌的影 响。方法采用熏烟和香烟提取物(CSE)分别诱导大鼠动物模型和A549细胞模型。运用肛 染色观察正常大鼠和熏烟大鼠肺组织病理改变，运用westernblot法检测大鼠肺组织细胞 内GR的分布和表达。结果HE染色提示熏烟大鼠烟较正常组肺泡壁毛细血管扩张、充血， 泡腔内充盈大量浆液性渗出物；熏烟大鼠肺组织细胞核和细胞质中GR表达量明显减少 (P0．05)，HDAC2表达明显减少。香烟提取物对A549细胞活性的影响呈时间一浓度依赖的趋 A549细胞GR表达减少，且细胞核中变化更加明显。结论香烟烟雾可减少肺组织及肺上皮 细胞内GR的表达，并增加粘蛋白E)C5AC的分泌，其机制可能与香烟烟雾减少GR对MUCSAC 的转录抑制机制有关。 关键词香烟烟雾，慢性阻塞性肺病，糖皮质激素受体，粘液分泌 obstructive 慢性阻塞性肺病(chronic pulmonarydisease，CoPD)是一种危害健康 的全球性疾病。吸烟是导致COPD的重要原因之一。香烟烟雾对呼吸道的影响一直是全球的 关注的热点。最近研究表明，糖皮质激素受体可能介导了气道粘蛋白删C5hC的转录抑制， 因此本文着重阐述了香烟烟雾对大鼠肺组织及A549细胞粘蛋白及糖皮质激素受体表达的影 响，从而进一步揭示香烟烟雾增加气道粘液分泌的可能机制。 1．材料和方法 1．1材料 1．1．1实验动物与细胞 任赠送。 1．1．2实验试剂 大前门牌过滤嘴香烟(烟碱含量O．8mg，焦油量11mg／支，一氧化碳含量13rag／支，上海 烟草集团有限责任公司出品)：脂多糖，MTT(美国sigma公司)；RPMI1640培养基，胎牛血 清(Gibico公司)；GR Cruz 公司)；羊抗兔IgG-Cy3抗体(武汉博士德公司)；DAPI(卿公司)；细胞核蛋白与细胞浆蛋 白提取试剂盒，BCA蛋白定量试剂(碧云天生物技术研究所)iTrizol(introvigen公司)， cDNA逆转录试剂，荧光定量PCR试剂(Takara公司)。 786 1．1．3实验设备 x x 50 Bio-rad电泳系统； 自制熏烟染毒箱：60 50(cm)；莱卡荧光倒置显微镜； i Quanttyone图像采集及分析系统；Bio-rad荧光定量PCR仪；Thermo酶标仪。 1．2实验方法 1．2．1动物的分组与造模 大鼠适应性饲养3d后，随机将10只大鼠分为2组，即：正常对照组和模型组。模型组 大鼠每日被放入自制熏烟染毒箱中烟熏，每次给予8一10支香烟，熏烟30min，每天2次，2 次熏烟间隔时间大于4小时，熏烟完毕将动物放回原饲养笼中正常进食进水，正常对照组大 鼠不接触香烟烟雾，正常食水饲养。 1个月后按照不同实验要求取材。 1．2．2香烟烟雾提取物(CSE)的制备 参照wu等的做法，按照每lOml培养基溶解300ml香烟烟雾，具体操作方法如下：用 然后上下晃动注射器80次，使烟雾充分溶解于培养基，重新抽取新烟雾，如此反复6次， 完成香烟提取物的制备。此烟雾提取物视为100％，使用时按照比例稀释。香烟提取物在配 置后lh内使用。 1．2．3病理切片与HE染色 将大鼠处死后取其左肺上叶置于10％福尔马林溶液固定、梯度酒精脱水、二甲苯透明、 浸蜡、包埋、切片和HE染色处理，于显微镜下观察各组大鼠肺组织形态学改变。 1．2．4Westernblot检测 取大鼠左肺下叶新鲜组织，按照细胞核蛋白与细胞浆蛋白提取试剂盒说明书操作，分别 分离组织细胞核与细胞质蛋白，保存于-70C冰箱待测。检测时，制作10孔电泳凝胶，每孔 Q I：1000，HDAC2 总蛋白量20ug，电泳及转膜后，分别