分子细胞生物学实验技术..docVIP

实验一 细胞传代 一、实验目的 学习细胞传代方法，扩增细胞，建立细胞系。 二、实验原理 培养细胞传代根据不同细胞采取不同的方法。贴壁生长的细胞用消化法传代；部分贴壁生长的细胞用直接吹打可传代；悬浮生长的细胞可以采用直接吹打或离心分离后传代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打传代。 三、实验材料 （一）仪器：净化工作台、离心机、冰箱（4℃、-20℃）、倒置相差显微镜、培养箱、细胞计数仪、 （二）玻璃器皿：吸管（弯头、直头）、玻璃瓶（250ml、100ml）、培养瓶、试管 （三）塑料器皿：枪头（10ul、100ul、1ml）、胶塞、15ml离心管、EP管 （四）其他物品：微量加样枪、废液缸 （五）试剂：PBS缓冲液、小牛血清、DMEM、双抗（青霉素、链霉素）、胰蛋白酶（0.25%+EDTA） 四、实验步骤 洗手进入超净工作室，显微镜下观察细胞状态，密度。 点燃超净台内酒精灯，打开所需试剂瓶，准备试管、吸管备用。 打开培养瓶，吸除瓶内旧培养液。 PBS缓冲液洗2次。 向瓶内加入消化液10滴，轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面，室温进行消化5分钟。 5分钟后把培养瓶放置显微镜下进行观察，发现胞质回缩，细胞间隙增大，部分细胞开始脱落，立即加入2mL培养基终止消化。 用吸管，吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，使细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液。 将细胞悬液转移至15mL离心管中，1000rpm/min，离心10min。弃上清，加入新鲜培养基2mL，重悬细胞。 计数，按1：2的比例分装到两个培养瓶中。 五、实验结果 上图为A549传代后细胞　×100 六、讨论 1.传代前，用适量培养基重悬细胞，计数，按照合适的比例分装细胞，避免细胞数量过多，而出现上图中24小时后即出现密度抑制，并有死细胞。 2．离心转速要合适，转速过低，不能有效分离细胞，离心速度过大，时间过长，会挤压细胞造成损伤甚至死亡。 实验二 细胞冻存和复苏 一、实验目的 学习细胞冻存和复苏的方法，掌握长期保存体外培养细胞的技术。 二、实验原理 细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存。细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久；细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。 细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。 三、实验材料 （一）仪器：净化工作台、离心机、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差显微镜、培养箱、细胞计数仪、恒温水浴箱 （二）玻璃器皿：吸管（弯头、直头）、玻璃瓶（250ml、100ml）、培养瓶、试管 （三）塑料器皿：枪头（10ul、100ul、1ml）、胶塞、15ml离心管、EP管 （四）其他物品：微量加样枪、废液缸 （五）试剂：PBS缓冲液、小牛血清、DMEM、双抗、胰蛋白酶（0.25%+EDTA）、DMSO 四、实验步骤 （一）细胞冻存 洗手进入超净工作室，显微镜下观察细胞状态，密度。 点燃超净台内酒精灯，打开所需试剂瓶，准备试管、吸管备用。 打开培养瓶，吸除瓶内旧培养液。 PBS液洗2次。 向瓶内加入消化液10滴，轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面，室温进行消化5分钟。 5分钟后把培养瓶放置显微镜下进行观察，发现胞质回缩，细胞间隙增大，部分细胞开始脱落，立即终止消化。 用弯头吸管，吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，使细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液。 将细胞悬液转移至15mL离心管中，1000rpm/min，离心10分钟。弃上清，加入新鲜培养基2mL，重悬细胞。 计数，按1：2的比例，1mL分装到培养瓶中，继续培养；另1ml分装入已加入100ulDMSO的冻存管中。 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者； 冻存：4℃30min, -20℃30min, -70℃30min,移入液氮容器内。 （二）细胞复苏 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。 从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀； 离心， 1000rp