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哺乳动物细胞培养制备重组蛋白质药物研究进展 张玉彬吴梧桐 (中国药科大学生物化学教研究室南京210009) 哺乳动物细胞培养表达制备治疗性重组蛋白质药物已成为当今生物制药领 域中的主流技术。目前大约有60％以上的重组蛋一质药物的生产采用哺乳动物细 胞培养技术。哺乳动物细胞制备的蛋白质药物质量高，它们1j天然蛋白质具有相 似的理化·忖质和乍物学功能。以默克、基凶泰克等围际大公刮为代表的大规模流 加培养生产工艺，其反应罐体积可以达剑10吨以上，蛋白表达浓度为 1．0—2．Og／L。我闻从2000年开始逐渐发展了该项技术，虽然起步较晚，基础较 差，但经过努力实现了该项技术的突破。本课题组目fi_iJiF．在开展哺乳动物细胞表 达重组蛋自和抗体药物的研究和技术开发。 1987年FDA批准了基因泰克公刮生产的tPA，这是世界上第一个哺乳动物细 胞制备的重组蛋一质药物，当时基因泰克公司借鉴了细菌大舰模培养技术，在搅 拌式反应罐中大规模培养悬浮重组ClIO细胞制备tPA。这是一项具有晕程碑性的 工作，标志着哺乳动物细胞制备重组蛋门时代的到来。 在过去的20多年中，哺乳动物细胞制备重组蛋白技术发生了巨大的变化。主 要表现在(1)细胞培养时间延长，由过去的7天延长至21天；(2)细胞密度 增加，由过去的卜2X106细胞／毫升，增加到现在的卜1．5X107细胞／毫升； (3) 产量增加，过去为10—20pg重组蛋白／细胞／天，50一100mg重组蛋白／升，而现在 则为50-90pg重组蛋白／细胞／天，卜59重组蛋白／升。这些变化的主要原因是人 们多年来对哺乳动物细胞大规模生产重组蛋白的关键之处进行了深入研究与优 化，主要集中在对细胞株、表达载体、基因转移、重组细胞筛选、培养基的组成 以及生物过程等方面的改造和优化。特别是补料流加技术的采用，使细胞在长时 间的培养过程中细胞数目多、且健壮活泼。遗憾的是这些技术掌握在少数公司手 中，没有公开化。为了提高重组哺乳动物细胞表达重组蛋白质的产量，一般可以 从以下两个方面着手：改进基因传输和遗传筛选的方法，以加速高产细胞株的发 现，另一方面则是开发高效的细胞培养系统，以便快速、低成本地筛选生物制备 过程的优化条件，通过优化补料策略提高细胞密度和细胞的存活率。为了减少成 本和节约时问，近年来国外又开展了大规模哺乳动物细胞培养瞬时表达(TGE)制 备重组蛋白的研究。 1． 重组细胞系 哺乳动物细胞大规模培养生产重组蛋白中，常用的细胞系有CHO和11EK293 两大类细胞。曾一度使用较多的COS细胞，由于强烈的贴壁作用，限制了大规模 悬浮细胞培养生产的实际应用。目前还有一些哺乳动物细胞株正在进行大规模培 174 养生产的研发中，如猿细胞衍生的Vero和CV-l，以及人的胚胎干细胞等。 上世纪80年代初期，Ringold等首次报道采用非病毒性基因转移技术获得 hamster 了稳定性转染外源目的基因的哺乳动物细胞株，即永生化CHO(Chinese ovary)细胞系。CHO细胞足第一批采用的宿主细胞，是一种_二氢叶酸还原酶营 养缺陷型细胞株。蟹白质制备过程中所采用的CHO细胞于1957年山Puck等人将 原代培养的中围仓鼠卵巢细胞的永4i化而获得。CHO—Kl足由原始CttO细胞衍生 的甘氨酸依赖型细胞株，并经进一步突变产牛为Cll沪DXBll，也称为CIIO-DUKX 或CHO-DUK-XBIl，这是一株DHFR缺陷型细胞株，这些细胞中已删除了一个dhfr 等位皋因，另一个等位基凶则产生了错义突变。CHO-pr03一细胞株为脯氨酸依赖 型细胞株，它被突变产生为CHO～D(；44，该细胞株则删除了dhfr的两个等位基因。 这些D11FR缺陷细胞株需要甘氨酸、次黄嘌呤和胸腺嘧I赃作为生长补允原料。 虽然CHO细胞最初并不足为了用。『．表达重组蛋白而制备的，fHDItFR删除的 CHO细胞易于制作稳定的转基凶细胞株。采J1j外源dhI、r与目的基闻共转染，通 过GHT缺少培养基可以筛选剑稳定的转染细胞株。这已成为一项标准的遗传筛选 方法，首先是将目的基因和dhf’r克隆在I司一表达载体或个别的表达载体。载有 两个基凶的质粒被转染到宿主细胞中，然后让细胞￡卜长在选择性培养基(缺少 GHT