2008牛精子蛋白质组学技术平台的建立和冻融前后.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，２８（７）：３７～４２ 牛精子蛋白质组学技术平台的建立及冻融前后 精子差异蛋白初步分析 １，２ １ ４ １，２ １ 陈　龙 　朱化彬 　沙里金 　韩伟东 　王　栋 ３ １ １ １ 王宗礼 　郝海生 　杜卫华 　程金华 （１中国农业科学院北京畜牧兽医研究所　北京　１０００９４　２甘肃农业大学动物科学技术学院　兰州　７３００７０） （３农业部畜牧业司　北京　１０００２６　４北京奶牛中心　北京　１０００８５） 摘要　通过探索不同的精子蛋白制备方法、水化液成分和优化２Ｄ电泳程序以建立牛精子蛋白质 组学研究技术平台，同时以牛鲜冻精为实验材料通过差异凝胶电泳寻找冻融前后精子蛋白的改 变。结果表明：使用改进的热ＴＲＩｚｏｌ法裂解精子细胞制备蛋白，结合优化的２Ｄ电泳技术可建立 稳定的牛精子蛋白质组学研究技术平台。差异凝胶电泳揭示牛精子在冻融后有质和量的改变： 冻融后缺失的蛋白点有２０个，表达下调的有２个，表达上调的有１０个。作为一项阶段性的实验 成果，研究建立的２Ｄ平台和所发现的冻融引起的差异表达蛋白质点为揭示冷冻损伤机理和性控 精液的差异蛋白质组学研究奠定了较好的基础。 关键词　精子　ＴＲＩｚｏｌ　差异蛋白 中图分类号　ＴＱ９３ 　　哺乳动物精子是经过一系列复杂生精过程而形成 全面了解精子蛋白质组成有助于研究正常精子形成的 的高度特化的细胞。作为传递生命遗传信息的载体， 分子机理，同时，运用双向电泳及其相关技术研究冻融 精子细胞核高度浓缩形成流线型的头部，细胞质浓缩 前后精子蛋白结构和功能的改变，有助于从蛋白质组 并转化为顶体、尾等，这些特殊的结构特点使得从ＤＮＡ 整体角度揭示精子冷冻损伤的分子机制。 ［１］ 　　本研究从细胞功能的执行者蛋白质入手，运用蛋 和ＲＮＡ水平对其研究存在一定的局限性 。而蛋白 质作为精子细胞发挥功能的结构基础，已成为学术界 白质组学理论和方法建立牛精子蛋白质组学研究技术 研究的热点。近年来，精子蛋白质组学在男性生殖医 平台，同时以牛鲜冻精为实验材料寻找差异表达蛋白， 学领域中广泛运用，并取得了一定的成果［２～４］。但是， 旨在通过揭示冷冻保存所导致的蛋白质组结构和功能 在动物繁殖领域鲜有此类研究报道。另外，影响冷冻 改变的实质，充分阐明冷冻损伤的机理，为家畜精液冷 精液在医学及畜牧学领域广泛应用的一大瓶颈是冻存 冻保存提供理论依据，从而促进精液冷冻保存技术的 后的精子从结构到功能都受到一定的损伤，表现为精 快速发展。 ［５］ 子运动持续时间减少，受精率降低等 。为了提高冻 １　材料与方法 精活率和受精率，科研工作者从冷冻稀释液成分和冷 冻方法等方面做了大量工作，但是进展并不明显，这主 １１　材　料 要是因为对精子冷冻损伤的确切机理尚不十分清楚。 １．１．１　精液样本　九头牛鲜冻精液均购自北京奶牛 中心。 收稿日期：２００８０１１４　　修回日期：２００８０４０８ 国家 “８６３”计划 （２００６ＡＡ１０Ｚ１４３）、国家 自然科学基金 １．１．２　主要试剂和设备　主要试剂：２ＤＣｌｅａｎＵｐＫｉｔ、 资助项目 （ ＴＭ ２Ｄｑｕａｎｔｋｉｔ、２４ｃｍＩｍｍｏｂｉｌｉｎｅ