细胞计数与细胞增.pptVIP

细胞计数及活力 细胞计数时的注意事项 ①消化单层细胞时，务求细胞分散良好，制成单个细胞悬液。否则会影响细胞计数结果。 ②取样计数前，应充分混匀细胞悬液。在连续取样计数时尤应注意这一点。否则，前后计数结果会有很大误差。 ③镜下计数时，遇见2个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计数。如细胞团占10%以上，说明消化不充分。 ④细胞数少于200个/10mm2或多于500个/10mm2时，说明稀释不当，需重新制备细胞悬液。 ⑤在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液时，加液量不要溢出盖片，也不要过少或带气泡。 ⑥在计数过程中，对大方格的边缘压线细胞应按数上不数下，数左不数右的原则进行计数。 ⑦染色标本在计数细胞时必须在15分钟内检查计数完毕。因为台盼蓝染液可以将死细胞迅速地染上蓝色，再延长时间则活细胞也将逐渐着色。 细胞增殖实验（MTT法） (一)原理 MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide, MTT（噻唑蓝）为基础。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。还原生成的formazan结晶可以用DMSO来溶解，利用酶标仪测定570 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。 (二)操作（实用于贴壁细胞） 1.接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000－10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul. 2.培养细胞：同一般培养条件，培养2-3天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。 3.显色：分别培养不同时间，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS 配)20ul.继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。 4.比色：选择570nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。 (三)结果 以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线或计算细胞生长抑制率、细胞相对增殖率等。 【注意事项】 1.选择适当得细胞接种浓度。边缘孔用无菌PBS填充。2.避免血清干扰：一般选小于10％的胎牛血清的培养液进行试验。在显色后尽量吸尽孔内残余培养液。3.设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零。每组设定3复孔。4.MTT粉末和溶液保存时都需要避光，用铝箔纸包好就可以。MTT一般最好现用现配，过滤后4oC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。 5.酶联免疫检测仪使用前应打开电源预热半小时。 6.选择不同的波长，酶联免疫检测仪检测灵敏度不同。应根据实验目的选择相应的波长。 7.悬浮细胞先用平板离心机离心96孔板，2000r，5分钟。或用cck-8。 应用举例 1. MTT实验 6孔板接种HCCLM3细胞，1*106每孔，后取1*107病毒每孔加入（LASS2与GFP对照），感染90分钟后，再加入1ml的培养液，24h后，细胞用胰酶消化成细胞悬液，细胞调密度至1000每孔接种96孔平底板，每孔100 ul（边缘孔用无菌PBS填充）。 5%CO2，37℃孵育24h后，每孔加入20ulMTT（噻唑兰）溶液（5mg/ml），继续培养4h。终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入150ul二甲基亚砜，37℃孵育15min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。细胞分为3组：LASS2组，GFP组和不加病毒对照组，每组3个复孔，同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜）。连续检测6天，OD值绘生长曲线。 结果：LASS2腺病毒感染HCCLM3细胞后，能抑制细胞的生长。采用Student’s t-test进行统计学分析，差异有显著性（p0.05）。 * 粘附:是大多数有机体细胞在体内生存和生长发育的基本存在方式 含义两方面：细胞与细胞间接触，细胞与细胞外基质结合。 结果：基于粘附特性，使细胞与细胞之间相互结合形成组织，使细胞与其周围环境间始终保持联系，使有机体内几乎不存在“自由”的细胞。即:有机体的绝大多数细胞必须粘附于一固相表面才能生存和生长。 * * * * * * 一、培养细胞的形态观察 体外培养的细胞主要有两种状态。一 种是