EGCG增强硼替佐米在原代肝细胞中对HBsAg抑制作用.pdfVIP

EGCG增强硼替佐米在原代肝细胞中对HBsAg的抑制作用 易学瑞1袁有成1张欣蕊1’2李娜。2孔祥平1 (1解放军第四五八医院全军肝病中心，广东广州510515： 2南方医科大学，广东广州510600) 摘要：目的研究EGCG及其联合硼替佐米对HBV转基因小鼠原代肝细胞的抗HBV作用及机制。方法采用改良的两步 灌流法分离HBV转基因小鼠原代肝细胞； 替佐米对HBV转基因小鼠原代肝细胞的细胞毒性；药物作用24h后，分别应用ELISA法和荧光定量PCR法测定细胞 培养上清中HBsAg和HBV-DNA含量；采用Westernblot法检测不同浓度EGCG和不同作用时间下细胞Hsp90的表达 硼替佐米对细胞无明显毒性作用； 时间的延长而增强。结论EGCG可以抑制转基因小鼠原代肝细胞HBV的复制，与lP啊ol·L-‘硼替佐米联用时对HBV 具有协同抑制作用。 关键词：EGCG；硼替佐米；HBV转基因小鼠原代肝细胞；乙型肝炎病毒；HBV-DNA；协同抑制作用：Hsp90 目前，乙型肝炎病毒(HBV)感染是全球范围内的一个严重的公共卫生问题，抗病毒治疗是慢 性乙型肝炎治疗的关键已成共识…。随着病毒耐药风险和HBV耐药变异复杂性的增加。如何解决乙 肝病毒耐药性问题已成热点心1。最近Thomas等人提出宿主细胞靶向治疗的抗病毒策略一调节病毒 复制各个阶段所依赖的相关宿主细胞蛋白，从而抑制病毒复制、减少病毒耐药n1。EGCG[(一) 可以通过诱导热休克蛋白(Hsp90)异常的构型改变，抑制Hsp90分子伴侣蛋白的功能H’。热休克蛋 白作为应激状态下的一类重要蛋白，可通过控制结合和释放来帮助被结合多肽在体内的折叠、组装、 转运或降解影响宿主细胞蛋白的合成∞’。本文采用HBV转基因小鼠原代肝细胞哺1，研究探索EGCG及 其联合蛋白酶体抑制剂硼替佐米在体外的抗HBV作用，并探索作用机制。 1材料与方法 雄性。 解成一定浓度后储存于-20。C，临用时用DMEM(含IO％FBS)培养基稀释至所需浓度。 Percoll细胞分离液购自Pharmacia；HBsAgELISA检测试剂盒购自上海科华；HBV—DNA荧光定 量PCR检测试剂盒购自广州华银；ELX800酶标仪购自美国BIO-TEK公司；ABIPRISM7000荧光 蓝博生物；二抗购自Santacruz公司。 1．4 HBV转基因小鼠原代肝细胞的分离纯化及培养例。 基金项目：“爱滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治”科技重大专项“十一五”课题(2008ZXlO002-011) Fax：020Email：xiangping_kong@hotmail．corn 78-U 1．5EGCG对细胞的毒性测定将分离纯化好的NBV转基因小鼠原代肝细胞(8×107·L。1)接种于明胶 包被的96孔板，100,1／孑L，37C5％CO：培养箱培养24h，待细胞贴壁后，设3个平行组(空 白对照组、溶剂对照组、EGcG组)，每组细胞分别加入培养基、含D～ISO(最大溶解浓度)以及 计算各组的平均抑制率和标准差。 1．6EGCG对ItBV的抑制作用新分离的HBV转基因小鼠原代肝细胞(8×107·L。1)接种于明胶包被 平行组(空白对照组、硼替佐米阳性对照组、EGCG组)，每组分别加入培养基、lPmol·L-1硼替 佐米(阳性对照药)∞1以及含不同浓度(最大无毒浓度以下)EGCG的培养基100p1，继续培养 24h，收集各组培养上清，测HBsAg和HBV—DNA含量。 10 1．7 7·L-1)分别接种于 EGCG对细胞Hsp90的抑制作用新分离的HBV转基因小鼠原代肝细胞(8X 明胶包被的6孔板，2ml／孑L。37C、5％co：饱和湿度的条件下培养24h，细胞贴壁后，设空白对 blot法检测不同组细胞中Hsp90的表达水平。 t2、24h后吸掉上清，提取细胞蛋白。Western ×107·L-1)接种于明胶包被的96孔板，IOOBl／孑L，37。C5％COz培养箱培养24