树舌多糖GF对小鼠HepA瘤p53、Rb与p16抑癌基因表达及细胞凋亡的影响.pdfVIP

树舌多糖GF对小鼠HepA瘤p53、 6抑癌基因表达及细胞凋亡的影响 Rb和p1 于英君1、张庆梅1、潘洪明2 1．黑龙江中医药大学生化与分子生物学教研室．黑龙江啥尔滨150040； 2．齐齐哈尔医学院，黑龙江齐齐哈尔161042) 摘要 对药用植物抗癌活性物质的大量研究表明，多糖类化合物作为高效低毒抗癌 有效成分之一，已越来越受到人们的重视。树舌，又称“老牛肝”、“扁木灵芝”，是一 种大型担子菌。树舌多糖GF(GADSGF)就是从树舌中提取的一个多糖组分。经多 次实验证明：它对小鼠移植型腹水型肝癌细胞瘤(HepA)有明显的抑制作用11j，可使 H∞A瘤血清和组织中某些异常的蛋白组分恢复正常。p53、Rb和p16均为常见的抑 癌基因，起着负调控作用，抑制细胞进入增殖周期，诱导终末分化和细胞凋亡，具 有潜在抑制肿瘤生长的功能，它们的功能失活或基因缺失、突变可导致细胞恶性转 化而发生肿瘤【“。因此p53、Rb和p16在肿瘤研究中有着十分重要的意义。 本研究利用①酶联免疫吸附测定法(双抗体夹心法)检测HcpA瘤组织中p53基 因表达水平；②免疫组化法(链霉菌抗生素蛋白．过氧化酶法)测定瘤组织中Rb和p16 基因表达水平，旨在探讨GADSGF抗肿瘤作用与p53、R_b和p16抑癌基因表达的关系。 @DNA琼脂糖凝胶电泳法，初步推测GAPSGF抗瘤机制与细胞凋亡关系。实验结果表明 ①树舌多糖GF能明显减弱肿瘤组织中突变型p53基因的表达，与阳性对照药猪苓多糖 ②相当。②树舌多糖GF能明显增强肿瘤组织中Rb和p16基因的表达，优于猪苓多糖。 ⑤树舌多糖组和猪苓多糖组的DAGE图谱均呈现大约200bp整数倍间隔的梯形条带， GAFSGF有促进肿瘤细胞凋亡的趋向。以上结果可初步说明使突变型p53基因表达减弱 Rb和p16基因表达增强和促进肿瘤细胞凋亡是树舌多糖GF抗肿瘤作用的部分机制， 促进肿瘤细胞凋亡也可能是这几个基因实现抗瘤作用的途径之一。树舌多糖GF有着 广阔的应用前景。 关键词： 树舌多糖(G峨猪苓多糖、Hep!A瘤、p{3、Rb、p1§、细胞凋亡、免疫组化法 ”酶联免疫吸附测定法、DNA琼脂糖凝胶电泳法 材料和方法 一、实验动物：昆明种小白鼠30只，20士琢，雌雄各半，由黑龙江中医药大学实验 动物中心提供。 12 二、瘤株：由黑龙江肿瘤研究所引进，以腹水传代。 三、主要试剂与材料： 法鉴定； (二)猪苓多糖注射液：连云港正大天晴制药有限公司产品，苏卫药准字《1999)) 第185701号批 Pan (三)主要试剂及仪器：p53 MARKES公司产品；链霉菌抗生物索蛋自过氧化酶免疫组化染色超敏试 荚国NEO 剂盒、DAB染色剂福建迈新生物技术公司产品；基因组DNA少量抽提试剂盒及DNA 128C酶标仪为奥 标准分子量，上海生工生物工程技术服务有限公司产品。CliniBio 地利产品；低温离心机为太仓医疗器械厂产品；超薄切片机产于北京六一仪器厂， OLYKMPUS显微镜为日本进口，多媒体彩色病理图文分析系统由同济医大提供； WFH-201型多功能紫外投射反射仪；uV．754分光光度计，上海第三仪器厂产品。 四、安验方法； 以o．2nll，只接种于小鼠右侧腋窝下。接种6h后开始肌注给药。将接种后的小鼠随机 分成三组：荷瘤对照组(给同体积生理盐水)、树舌多糖组50rng／kg／a)及猪苓多 糖组(1mg／kg／d)。连续给药，每日一次，直到荷瘤对照组肿瘤达到lg以上，于末 次给药24h后处死小鼠，剥离肿瘤组织。 (二)p53蛋白含量的测定：将组织放于冰上，加入5倍体积的低盐RIPA缓冲液裂解 组织，匀浆器碾碎，离，tL,，取上清且稀释到合适浓度。将标准品及样品加入酶标板 中，孵育，使其与事先结合在酶标板上的生物素标志抗体结合，最后加显色剂，使 其显色，放入酶标仪中测定A值。 (三)Rb、p16蛋白含量测定：标本固定、脱水、透明、浸腊、包埋、切片、脱腊和水 化，PBS冲洗，依次加入过氧化酶阻断溶液、