利用over+lap-PCR获得秦川牛SHH基因及其真核表达载体构建.pdfVIP

I 利用overap-POR获得秦川牛SHH基因及其真核表达载体的构建 孙晓梅，滑留帅，李明勋，蓝贤勇，雷初朝，陈宏+ (西北农林科技大学动物科技学院，陕西省农业分子生物学重点实验室，陕西杨凌，712100) 关键词：overlap．PCR，牛，SHH基因，载体构建 引言 基因克隆是基因功能研究的第一步，overlap—PCR在构建重组DNA和基因定点突变等方面应用 广泛，但在克隆基因上的应用不多见。由于基因组DNA相对比较容易获得，直接从基因组中扩增目 片段，进而使用PCR拼接成一个完整的目的基因的方式将大大降低克隆的成本，提高克隆的效率。 Hedgehog信号通路是动物发育的重要信号通路之一，其参与调节动物的胚胎发育，体节形成，脊索 发育、大脑发育等重要过程，并且影响白色脂肪细胞的分化，同时在脂肪分化中的作用在物种间具 有保守性。Hedgehog在哺乳动物上有三个同源基因： 达载体，对进一步研究其在牛脂肪分化中的作用以及牛脂肪沉积机理的阐明具有重要意义。 材料与方法 007302和XM614193 采集秦川I牛血样，用常规酚氯仿法提取基因组DNA，根据GenBank中NC 设计引物(由于Exon3只有5 克隆，之后进行序列的克隆测序验证、生物信息学分析及秦川I牛SHH．pEGFP—CI重组质粒的构建。 结果 经过蓝白斑筛选后挑单克隆扩大培养，提取质粒后用EcoRI单酶切鉴定阳性克隆，并将其送测序。 测序结果与GenBank中预测的海福特牛的SHH序列(XM614193)相比存在一个TC的点突变， 件对其进行跨膜结构预测分析，表明SHH的N端存在一个跨膜区：使用NN和HMM算法对其信号 肽进行预测，结果表明SHH的N端存在一个信号肽，信号肽的剪切位点在23和24位氨基酸之间； 讨论与结论 使用overlap—PCR克隆基因最大优势使不受目的基因的组织表达谱影响，样品容易获得。第二 序列与GenBank的序列高度一致。通过对其蛋白质的跨膜结构、信号肽及亚细胞定位分析表明，牛 其功能，并且这个通路在牛上也是保守的。牛作为反刍动物，SHH信号通路在牛脂肪沉积中的作用 也有待进一步的探讨，但至少生物信息学分析表明牛SHH蛋白的胞外表达特征与其在SHH．Ptc—Smo 其克隆至真核表达载体pEGFP—C1上，下一步可将其转染至牛前体脂肪细胞系，进一步研究其在牛 脂肪沉积中的作用。 致谢 术体系专项(No．Nyeytx一38)项目资助。 宰通讯作者：chenhongl212@263．net．