结缕草(Zoysia+japonica)抗寒相关转录因子zjDREB1基因克隆、表达模式及功能分析.pdfVIP

结缕草(Zoysia 克隆、表达模式及功能分析 王舟张芳刘建秀· (江苏省中国科学院植物研究所，南京210014) 结缕草(Zoysiajaponica)是目的正在国内外广泛应川的上要暖季型草坪草之一，具 有弹性好、耐践踏、养护投入低等优良坪用特性，是绿化、足球场草坪和高尔夫球场草坪的 主要建群种。假俭草(Eremochloa ophiuroides)是禾本科蜈蚣草属多年生宿根性优良草坪 植物。’言具有叶形优美、丰I．c株低矮、养护水半低、耐贫瘠、病虫害少等优点，广泛应用于庭 院草坪、休憩草坪以及水土保持的草坪建设巾。然I酊，fhf假俭草抗寒性相对较差且枯黄期 长，限制了其在噩热带北部及温带地【又：的广泛应用。因此，提高优良假俭草品种的抗寒性对 于扩大其应用范同具有重要意义。 由于我困结缕草相关研究rT作起步较晚，其功能基冈n勺发搬和分了：疗种有待进一步深入 研究。为了揭示草坪草抗逆分子机制，获得具有自主知识产权的优良抗逆基因，本研究在筛 选抗寒性强的结缕草品种的基础上，克隆其抗寒相关转录凶子ZjDREBl基因，并对其表达模 式和功能进行了分析。以假俭草优良品系‘E-126’为材料，以克隆ZjDREBI基因为目的基 因，采用农杆菌介导法进行遗传转化研究，建立并优化了遗传转化体系：采用PCR和荧光定 量PCR技术对抗性植株进行分子检测，并对转基因后代进行抗寒性的生理鉴定。 主要研究内容和结果如下： 1．以美国引进的并在国内外草坪生产上普遍应用的结缕草三个优良品种_Meyer (Zoysiajaponica cv．Lanyin3)为试验材料，通过叶片电解质外渗法，利用半致死温度(LTso)为 japonica 评价指标，鉴定各品种的抗寒性。结果表明，三种结缕草品种的半致死温度(LTso)分别为 抗寒性南强到弱依次为MeyerPalisades兰引3号。 2．根据结缕草近缘植物DREB转录因子的AP2／EREBP保守结构域序列，通过RT—PCR和 RACE的方法从冷诱导的抗寒结缕草品种中扩增到了一个新的DREB同源基阗，命名为ZjDREB] (GenBank登录号：GQ848096)。该基因的开放阅读框(ORF)为774bp，编码257个氨基酸， kDa和5．53。序列分析表明，ZjDREBl推测的蛋白具备 分子量和等电点(pI)分别为28．85 酸性激活区。根据高等植物肌动蛋白相似性构建的系统进化树显示，结缕革ZjDI范BI与狗牙 和1个内含子组成。这是首个从结缕草中分离得到的DREB类转录因子基因。 3．为在研究ZjDREBl基因的表达模式时提供分子内参，采用RACE技术扩增出1560bp 的结缕草肌动蛋白基因全长cDNA序列。序列分析表明，该基因的开放阅读框(ORF)为1134 bp，分子量和等电点(pI) bp，编码377个氨基酸，5’非编码区117bp，3’非编码区309 kDa和5．23。所得序列与GenBank中收录的其它植物肌动蛋白核苷酸序列的 分别为41．72 一致性均在85％以一}：，氨基酸序列的一致性高达97％以上。将其命名为ZjACT,GenBank登录 号为GU290545。根据高等植物肌动蛋白相似性构建的系统进化树显示，结缕草肌动蛋白 ZjACT与大麦Hvactin和圆锥小麦丁叫俨J肌动蛋白之间的亲缘关系最为密切，在进化中分 化时间最为接近。进一步分离克隆了结缕草Actin基凶的基凶组DNA序列(GenBank登录号 GU290546)，分析发现其由4个外显予和3个内含子组成。本研究有助于揭示植物Actin基 因家族的进化历史，为研究植物Actin基因家族功能和进化上的多样性奠定理论基础，同时 也为开展草坪草和牧草Actin基凶的功能分析和利用研究提供参考。 4．以克隆得到的结缕草肌动蛋白基冈刎卵为内参，利用实时定量PCR方法分析了三 个结缕草品种ZjDREBl基因在冷胁迫处理F的表达差异。结果表明，室温卜．ZjDREBI基本没 h后，该基因丌始被诱导，并在持续的冷胁迫下表达量快速增加，处理 有表达。4℃处理1 6h后，表达量达峰值。抗寒性强