支原体和肺支原体双通道荧光定量PCR法建立及其在小鼠检测中应用.pdfVIP

第九届中国实验动物科学年会(2010．新疆J) F33．支原体和肺支原体双通道荧光定量PCR法的建立及其在小 鼠检测中的应用 傅军 吴宜栋★余钟声★ 浙江大学实验动物中心 幸浙江大学附属儿童医院 【摘要】目的建立能同时检测支原体通用型和肺支原体特异型的双通道荧光定量PCR方法。并在小鼠检测中进 行应用。方法：采用1细M锄探针法进行支原体通用型和肺支原体特异型的双通道荧光定量PCR。取大肠杆菌、表 皮葡萄球菌、人巨细胞病毒、肺炎支原体、乙型肝炎病毒、大鼠、小鼠和人基因组等作特异性试验。对5个浓度分 别为3个／gL、3x10个／止、3x1 份小鼠气管标本、22份经支原体培养后的标本，进行支原体和肺支原体的双通道荧光定量PCR法检测。荧光定量 PCR阳性产物纯化后．通过测序来验证结果。结果：确认支原体和肺支原体双通道荧光定量PCR引物和探针序列为， ．3-BHQ．1。与大肠杆菌、表皮葡萄球菌、人巨细胞病毒、肺炎支原体、乙型肝炎病毒、大鼠、小鼠和人基阂组等均 无交叉反应。最低可检测到lO个肺支原体。在气管标本中检测到肺支原体阳性3份；培养标本中检测到肺支原体阳 性3份(其中2份同气管标本)；219份标本中5份通用型支原体阳性(肺支原体阴性)，提示标本中含有其它种类的 支原体。6份肺支原体PCR阳性标本。经测序对比，与肺支原体序列一致。结论：建立了能同时检测支原体通用型 和肺支原体特异型的双通道荧光定量PCR方法，检测快速(3小时以内获得结果)，敏感性高。为实验动物小鼠的高 效管理提供r有力的保障。 国家科委、卫生部在有关实验动物管理法规中都要求，清洁级以上实验动物大、小鼠应排除鼠肺支原体。目前 国内多采用体外培养法和血清学法，培养法要求条件苛刻、费时、操作极为繁杂，灵敏度却较低，需要进行麻烦的 分离培养鉴定才能得到结果；血清鉴定方法则存在种属之间的交叉反应问题，并且支原体感染的前面数天甚至几个 星期无法从血清中检测到，大大影响实验动物管理效率。故建立特异、灵敏、快速的PCR法检测技术，检测鼠肺支 原体感染是十分必要的。 本文通过建立能同时检测支原体通用型和肺支原体特异型的双通道荧光定量PCR方法，以期建立一种敏感和特 异的检测方法。通过一次实验，确认是否有支原体感染，并且能同时确认是否有肺支原体感染，真正达到快速、敏 感和特异，为实验动物的高效管理提供有力保障。 l方法 1．1引物、探针的确定和合成 应用MegAli印软件分析肺支原体等多种支原体16sRNA序列目的片段，设计并筛选2对通用引物和探针序列， 引物和探针序列分别为： bp。 第一套引物序列为，5’．19bp．3’；5’．21bp一3，目的片段长度148 5’．HEX一22bp-3-BHQ—l。探针均经 呦M鲫探针为，支原体通用型：5’FAM一21bp一3-BHQ-l；肺支原体： 高效液棚(HPLC)纯化。 纯化。引物和探针由上海生工生物工程有限公司合成； 1．2．荧光定量PCR反应体系 在AB[7500仪器进行荧光定量PCR反应。反应体系25pl，各引物和探针浓度分别为0．4I上InolFL和0．2pmol／L， 限公司TAKARA提供)，上清液模板为3m，其余用ddH20补足至25d。 第九届中国实验动物科学年会(2010．新疆．J 1．3．标本DNA的获得 000 r／rain离心10min，弃上清， 已采集好标本的支原体传送液1000“L，或已培养结束的培养液标本100止，12 mmol／L 在沉淀中加入50ttl抽提裂解液混匀(10Tri．HCI，PH7．6，5mmol／LEDTA，0．5％SDS)置100℃煮沸10min, 12000 r／rain离心5min，取3m上清液作为PCR模板。 1．4．荧光定量PCR特异性试验 取大肠杆菌、表皮葡萄球菌、人巨细胞病毒、肺炎支