终板下椎体自身免疫反应动物模型建立及其评估.pdfVIP

第四届中华骨科杂志论坛天津·2012 终板下椎体自身免疫反应动物模型的建立及其评估 韩超马信龙王 马雄田鹏 加成 天津市天津医院300211 腰椎间盘退变所致的腰痛是美国45岁以下患者因活动受限而就诊的第二大疾患，在美国最常需 要手术治疗的疾病中名列第三位。据估计，其治疗的 费将千美元。腰椎终板下椎体信号改变 (Modic changes)多见于腰腿痛患者，其由de 行了系统描述。 在临床工作中往往能够发现这样的现象：在有Modic改变出现的腰椎间盘出患者MRI上，在逐层的 出部位时，其 扫描图像中我们能够发现，并非每一扫描层面均有Modic改变出现，而往往只有当扫描到 Modic改变才逐渐显现出来，当离开出部位时，Modic改变就逐渐消失了。这一现象预示着Modic改变 的发病可能与髓核的暴露密切相关。当前对于Modic改变的研究多限于其流行病学方面，由于缺乏适合的 人体标本，所以建立一个稳定的Modic动物模型就显得十分必要。本实验旨在制作终板下椎体自身免疫反 应动物模型，从而对Modic改变的发病机制进行更深层次的探索。 l材料和方法 1．1实验动物 3月龄新西兰大耳白兔54只，体重2．5-3．OKg，雌雄各半，(由天津医科大学动物实验中心提供；单 笼饲养，喂食普通兔饲料，充足饮水，保持笼内清洁，动物干燥、安静、清洁、通风好，温度适宜。分 和正常对照组(n=18)。于术前全麻后行腰椎X线及MRI检查，确认腰椎无先天畸形病变。 1．2实验方法 ． 1．3兔终板下椎体自身免疫反应模型的建立 3组动物按5ml／kg的剂量，给予20％基甲酸乙酯溶液耳缘静脉麻醉成功后，备皮、消毒，模仿 人腰椎间盘前外侧入路的手术体位，将兔右侧卧位固定于与水平位45。角。消毒，铺单后，以家兔两 侧髂嵴最高点连线与脊柱相交处为腰6／7棘间隙的解剖特点来定位腰4／5棘间隙。从此点作对侧各横 突尖连线的垂直线，以交点为中心纵切口长约5 米，依次切开皮肤、皮下筋膜、腹外斜肌、腹内斜 肌、腹横肌，使用生理盐水 布钝性分离后腹膜与腰大肌，保护腹主动脉、下腔静脉，分离腰大肌， 暴露腰4／5、腰5／6椎间盘左前外侧，使用16G骨穿针在腰5／6椎问盘紧邻骺板的椎体处钻孔，深度 约3毫米；利用5毫升空针刺入腰4／5椎间盘中，抽取髓核。按照各实验组的要求，分别将髓核、肌 肉推入至已钻孔的椎体内，并使用钻孔时所残留的骨块填塞完整。止血、冲洗后缝合各层组织和皮肤， 并覆盖以碘伏布，包扎固定。正常对照组仅进行钻孔和骨块填塞，不置入任何组织，其它操作与实 验组相同。 1．4标本的获取 验处椎体信号的变化。采用空气栓塞法处死动物后，整块断取L3到L6脊椎，除肌肉及其它软组织后， 肉观察椎体钻孔部位色及外形，DEPC水配制的PBS溶液冲洗后，一半的标本置于10％甲醛固定液中， blot检测。 用于病理检查：另外一半标本迅速置于液氮中保存，用于PCR及Western 1．5脏染色 将所取标本用10％中性甲醛溶液(0．1摩尔／升，pH=7．4)4℃固定4天。 表面颜色并用物理法测定其脱钙程度。 脱钙完全后取材，梯度乙醇逐级脱水。 二甲苯透明处理2小时，石蜡包埋。 制成4微米厚切片，常规旺染色。 第四届中华骨科杂志论坛天津·2012 1．6实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应 1．6．1组织总RNA的提取 ①将兔椎体组织从液氮中取出，立刻称重。 ②将组织置于预冷的研中，边加液氮边研磨，直至成为碎末状。 ③每100毫克组织加入Trizol(SIGMA)200微升，继续研磨直至融化。 ④将裂解产物移至RNase-free的1．5毫升离心管中，每管l毫升。 加预冷的氯仿200微升／管，旋混匀，冰 10分钟。 4C，12 000rpm离心15分钟，小心吸取上层水相至新管。 加