应用抑制性消减杂交技术克隆NS5ATP4反式激活基因.pdfVIP

343 生耍匿壁盘壁瘟盘壶21鲤生箜13整箍§塑 应用抑制性消减杂交技术克隆NS5A—TP4反式激活基因 杨倩成军刘妍王建军洪 源党晓燕纪冬王眷花张树林 中国人民懈放军第302医院传染病研究所基固治疗中心(北京．100039) 摘要 目的：应用抑制一雎消减杂交(ssH)技术构建人类新基因NS5～TP4反式激活基因差异表迭的cDNA消减 l 文库．克隆NS5A-TP4反式激活相关基目，了解该基因的可能生物学功能。方法：以Ns5A．TP4表迭质粒pcDNA3 1(一)转染的HepG2细胞为对照；制备转染后的细胞裂解液，从总 (一)．TP4转染HepG2细胞，以空栽体pcDNA3 }乇NA中提取mRNA并逆转录为cDNA，经RsaI酶切后，将实验组d)NA分成两纽，分剐与两种不同的接头衔接，再 与对照组cDNA进行两次消减杂交厦两班抑制多聚酶链反应(PcR)，将产物与pGEM．1诬y载体连接，构建cDNA消 减文库，并转染太肠杆前进行文库扩增，随机挑选克隆PcR扩增后进行测序度同源性分析。结果：成功构建人类新 基因NS5A-11)4反式激活基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后得到63个白色克隆，进行茼落}】cR分析，均 得到2(10～100IJbp插入片段。挑取含有插入片段的36个克隆进行刹序，并通过生物信息学分析获得20种已知功能基 因序列和5个未知功能基因。结论：应用ssH技术成功构建了Ns5A_TP4反式激活基因差畀表达的cDNA消减文库。 谊吏库的建立为阐明NS5A-TP4生物学功能提供理论依据。 关键词分子生物学；反式激活；押制性消减杂交；克隆 and of NS5A-TP4Protein AnalysisExpressed(沁nes’rransactivated Cloning by SubtractiVe bySuppression I{ybridjzation YANGQ弛n，cHENGj洲，uU 302 Y姗．n以G鼎P1讯㈣衙Re妣rch【洳zcr，IH《ifM糖o，I}l舡n【州1)眦螂，Tk H“加mz盯凸l”蹦尸L^(B彬’w，100039)02糊 Abstr越t0bjecIive：T。㈣structasubtractivecDNA of librarygell幅tr瑚ctivate(1by NS5A．7I、P4u目rIg h。m()Sapj印s tocble associatedwlthlts “1ppresslmH山r刖1ve}啦l衍dlzati(m(SSH)techn；que姐dg朗es t蛐1嘲ctjvatln窟fLIncti)n．Methods： 7rkmRNAwasLR)lat。d吣n ce¨stransfecte(i HepG2 v僦or，re— pcDNA3．1(一)Ns5～TP4删pcDNA3．1(一)∞ptv cDNA刖。terrestndlon sp忧“ve}y似8yn【hcsIze 011，锄allsu心c[)NAwe坤()btalned’rhent舀tercDNA cI“ynle脚Idig心t1 waS into and曲ch