镉对河南华溪蟹卵黄磷蛋白在卵巢中表达含量de影响及ELISA法de建立.pdfVIP

第39卷 第2期 水 生 生 物 学 报 Vo1．39．N O．2 2015年 3月 ACTAHYDR0BIOL0GICA SINICA Mar．， 2015 doi：10．7541／2015．38 镉对河南华溪蟹卵黄磷蛋白在卵巢中表达含量的影响 及 ELISA法的建立 杨 健 刘冬梅2 何永吉 汉斯达·姆斯。 王 兰 (1．山西大学生命科学学院，太原 030006；2．山西医科大学基础医学院，太原 030006； 3．高雄医学大学生命科学院，高雄 80708) 摘要：为了探究镉对河南华溪蟹(Sinopotamonhenanense)的卵子发生的影响，通过凝胶过滤层析法纯化了成 熟卵巢中的卵黄磷蛋 白(Vitellin，Vn)，采用 SDS．聚丙烯酰胺凝胶电泳确定了Vn亚基数量及分子量，以纯化 的Vn为抗原制备了Vn多克隆抗血清并建立了可靠的Vn含量测定的ELISA方法。采用氯化镉体外亚慢性 染毒的方法，运用 Vn．ELISA方法检测镉暴露对卵巢组织中Vn含量的影响。实验设对照组和 5．8mg／L镉处 理组，处理时间分别为 10、15和 20d。结果显示，(1)SDS．聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明该蛋 白由分子量为 102、84和70kD的3个亚基组成，同时Western—blotting检测表明，抗血清对该蛋白具有较强的免疫特异性； (2)在Vn．ELISA中，Vn抗体最佳稀释倍数为 1：100000，该方法的工作浓度范围为 125--2000ng／mL，定性 检测的灵敏度可达到 15．62ng／mL；卵巢中Vn含量测定的结果中各批次间没有显著差异，且平均变异系数分 别仅为7．81％，表示该法具有较高的稳定性和重复性；(3)镉引起卵巢组织中vn含量的显著降低，与镉处理 时间具有时间．效应关系，说明了镉暴露可影响河南华溪蟹卵母细胞的成熟并对卵子发生产生抑制作用，进 而影响卵巢的正常发育。 关键词：河南华溪蟹；卵黄磷蛋白；SDS．聚丙烯酰胺凝胶电泳；酶联免疫吸附法；镉 中图分类号：X174 文献标识码：A 文章编号：1000．3207(2015)02．0287—07 镉在工业中的大量使用导致其成为环境中大量 损伤是永久的，这将会长期影响水生环境 中物种的 存在的非必需金属元素之一，同时也成为水体污染 繁殖过程进而影响生物种群及生态系统，因此探究 中一类典型的环境污染物 。本实验室早期研究发现 可反映污染物对生物早期影响的繁殖参数是水生生 镉可以在河南华溪蟹(Sinopotamonhenanense)卵巢、 态毒理学研究中急需要解决的问题。 肝胰腺、鳃 以及肌肉等组织中富集，导致生物体产 卵子发生是甲壳动物卵巢发育中的一个重要阶 生急性或慢性中毒，造成组织器官出现不同程度的 段，表现为卵母细胞中卵黄蛋 白原(Vitellogenin，vg) 损害，如镉诱导的细胞坏死 、细胞凋亡和脂质过氧 的形成和积累p]。在卵巢中，Vg会通过进一步的修 化反应 [一‘】。韩托等[]研究发现在镉富集 的水域生 饰和加工形成包含有Vg、脂类 、碳水化合物和色素 物个体大量死亡，这直接导致水生生物种群数量和 等物质的卵黄磷蛋 白(Vitellin，Vn)，并在卵母细胞 生物多样性显著降低。此外，研究发现镉会对鱼类、 中积累形成卵黄体。Vn是甲壳动物卵子存活和胚胎 蟹类和鸟类的脂质、糖类和蛋 白质代谢产生影响， 发育所需营养物质的主要来源，卵巢中 Vn积累的 从而影响物种 的迁徙和繁殖[6--8]。同时由于镉的半 多少直接影响到其后生殖过程和幼体质量 。因此 ， 衰期较长，通过消化及呼吸系统进入机体后造成的 Vn可作为研究甲壳动物繁殖的重要生物指标[1们。此 收稿 日期：2014-09—04；修订 日期：2014．