应用16S+rDNA克隆文库法分析B6-Co小鼠角膜炎细菌组成.pdfVIP

华东地区第十三届实验动物科学学术交流会 应用16SrDNA克隆文库法分析 B6一Co小鼠角膜炎细菌组成 宋鸿雁1，仇保丰2，刘春1，朱顺星1，缪进1，王生存1，吴刘成1，王旭1，邵义祥1 (1．南通大学实验动物中心南通大学比较医学研究所，江苏南通226001； 2．南通出入境检验检疫局动检科，江苏南通226004) [摘要]目的鉴定B6-Co突变系小鼠角膜的病原菌组成，与人类细菌性角膜炎病原菌组成比较分 析。方法选取C57BL／6(B6)小鼠和C57BL／6一Corneal rDNA 文库随机测序法分析10日龄B6一Co角膜混浊小鼠角膜组织刮取物细菌组成，B6小鼠作为对照。结 果B6一Co角膜混浊小鼠中共鉴定出20种细菌，隶属于15个属包括葡萄球菌属、假单胞茵属、链球菌属、 微球菌属、棒状杆菌属等。葡萄球菌属和假单胞茵属为优势属，葡萄球菌属丰度为19．7％～53．1％，假单 胞茵属的丰度为17．4％～32．8％。其中葡萄球菌属主要是表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)， 丰度为13．8％～20．9％，缓慢葡萄球菌(Staphylococcus 也比较常见。10日龄B6小鼠对照组未检测出细菌。结论B6一Co突变系小鼠角膜细菌组成与人类角膜炎 病原茵相似，是一个研究人类角膜炎诊断方法、发病机理及临床用药的很好的动物模型。 rDNA克隆文库；细菌组成 [关键词]细菌性角膜炎；16S 角膜病在眼科临床是一种常见病，也是比较严重的致盲的眼病之一【I】。角膜疾病病因有多种，其中 炎症引起的角膜病占首要地位【2】。近年来，细菌性角膜炎的发病率在我国呈现明显升高趋势【3卅。准确的 病原学诊断是合理治疗角膜病的关键，然而目前细菌性角膜炎病原学诊断仍缺乏有效的方法，研究显示， 35％～60％的感染性角膜病病例在目前的诊断条件下无法查到病原体，使得角膜病的临床诊断和治疗面l临 许多困难。目前细菌菌群分析中应用最多的是16S 诱变技术获得并建立的具有角膜混浊表型的突变系小鼠，该模型小鼠E16．5时上下眼睑闭合缺陷，出生后眼 睑开裂，后逐渐发展为角膜混浊【5】。本研究拟采用建立16SrDNA克隆文库随机测序的方法揭示B6．Co小 鼠角膜浑浊的细菌组成，为人类角膜病的诊断和治疗提供依据。 1材料与方法 1．1材料 项目(12R082) [作者简介]宋鸿雁，(1982．)，女，博士，讲师，研究方向为人类动物疾病模型。Email：songhongyanv@ntu．edu．cn [通讯作者]邵义祥，Email：shaoyx@ntu．edu．cn ．162． 华东地区第十三届实验动物科学学术交流会 大学实验动物使用管理办法及国家相关规定。 Vector rDNABacteriaIdentification 1．1．2主要实验试剂及仪器pGEM．TSystem(美国Promega公司)；16S PCR 22331 5417冷冻离心机、EppendorfAGHamburg 酵母浸提物和胰蛋白胨(英国OXOID公司)。Centifuge Drop⑩OD一1000紫外一 PCR仪(德国Eppendorf公司)；DYY-6B型稳压稳流电泳仪(北京市六一仪器厂)；one 可见光全光谱分光光度计(上海中天生物科技有限公司)。 1．2方法 无菌镊子将上下眼睑分开，充分暴露角膜，用无菌刀片刮取角膜组织。B6一Co小鼠则刮取病灶及其边缘组织。 t．tL 将刮取物置于加有500 TE的无菌Eppendorf管内。 min，弃去上清，收集沉淀。往 1．2．2细菌基因组DNA的提取将含有刮取物的Eppendorf，12000