致农民肺嗜热吸水链霉菌cDNA文库的构建及其相关基因的表达.pdfVIP

致农民肺嗜热吸水链霉菌cDNA 文库的构建及相关基因的表达 凌媛 王玲玲 刘朔 马列 王群 张丽娇 何晓雨 赵明静 王笑歌 【摘要】目的：构建致农民肺嗜热吸水链霉菌cDNA 文库并进行EST 测序，通过 生物信息学软件分析EST 序列同源性及生物学功能，并对其中具有毒力作用的基 因进行体外克隆并诱导表达。方法：利用SMART 方法构建致农民肺嗜热吸水链霉 菌的cDNA 文库，并从中随机挑选了1020 个克隆进行EST 测序。用生物信息学方 法分析EST 测序结果，并筛选出可能引起人体免疫反应的毒力因子。将这些目的 基因克隆至pET-28a 载体中，在大肠杆菌BL2 （DE3）中转化，通过IPTG 进行诱 导蛋白质的表达。结果：成功构建了含有978 个有义序列，347 个单一基因的较 高质量的致农民肺嗜热吸水链霉菌cDNA 文库。该cDNA 文库中含有两段全长分别 为1713bp 和768bp，并编码517 和254 个氨基酸的基因，这两段基因与猪胸膜 肺炎放线菌外膜蛋白（omla），转铁蛋白B （TbpB）的同源性分别为51%和42%。 将这两段基因克隆至原核表达载体中，用宿主IPTG 诱导得到表达产物的分子量 分别为63kDa 和30kDa。结论：所构建的致农民肺嗜热吸水链霉菌cDNA 文库包 含全部EST 序列，可能包含嗜热吸水链霉菌相关疾病巨大部分毒力分子，这些 数据的积累将有助于农民肺特异性毒力分子的进一步筛选，同时为研究农民肺的 发病机制奠定基础，如果能准确筛选出相关毒力基因，将为农民肺血清学诊断以 及特异性疫苗的研发奠定基础。 【关键词】嗜热吸水链霉菌；cDNA 文库；农民肺；抗原；EST 基金项目:国家“十一五”科技支撑项目 （2007BAI24B04）；中华医学会基金 （07010320040）；中华医学会基金（08020680146）；辽宁省教育厅基金（2009A760） 作者单位：110032 沈阳，中国医科大学附属第四医院呼吸内科 （凌媛、王玲 玲、刘朔、马列、王群、张丽娇、何晓雨、赵明静、王笑歌） 通信作者：王笑歌，Email: cm4hwxgn2005@126.com cDNA library constructing and specific antigen expression of Streptomyces Thermohydroscopicus LING Yuan ，WANG Ling-ling，LIU Shuo ，MA Lie ，WANG Qun，ZHANG Li-jiao ，HE Xiao-yu ，ZHAO Ming-jing ，WANG Xiao-ge. *Department of Respiratory Medicine，the Fourth Affiliated Hospital of China Medical University， Shenyang 110032 ，China Corresponding author: WANG Xiao-ge, Email: cm4hwxgn2005@126.com, Department of Respiratory, the Fourth Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110032, China 【Abstract 】Objective To construct a cDNA library from Streptomyces Thermohydroscopicus and obtain two recombinant fusion virulence proteins by using a prokaryotic expression system. Methods The Streptomyces Thermohydroscopicus cDNA library was constructed by switching mechanism at 5’end of RNA transcript approach. A total of 1020 clones randomly selected from the cDNA library were s