膜片钳技术在心律失常的研究中的应用动物生理学.docVIP

膜片钳技术在室性心律失常研究方面的功能 生命科学学院2011级 2011012911 姜悦 摘要：心律失常研究的复杂性,与心脏分布着众多离子通道密切有关。应用膜片钳技术可以直接记录细胞膜离子通道的活动,研究“开”、“闭”动力学,离子通透性及选择性等,并且采用先进的计算机技术对离子通道活动的记录进行分析。在通道电流记录中，可分别于不同时间、不同部位施加各种浓度的药物，研究它们对通道功能的可能影响，了解那些选择性作用于通道的药物影响心肌生理功能的机理。这是目前膜片钳技术应用最广泛的领域。本文将就膜片钳技术在室性心律失常研究方面的功能加以阐述。 关键词：膜片钳 心肌电生理 室性心律失常 离子通道 药物筛选 伊布利特 20世纪60年代后期，科学家们发现能够应用微电极测量人工制造的具有双层脂膜的蛋白质单通道电流。这种方法后来被德国神经生物学家Erwin Neher和Bert Sakmann在1976年发展并应用在活细胞上，这就是后来被称为膜片钳的神经生理学技术。膜片钳技术的核心是能够记录单一离子通道电流。玻璃微电极尖端经抛光后贴附于神经元膜上，与玻璃微电极尖端相接的膜仅含1-3个离子通道，然后通过负压吸引将这片膜与周围的膜实行高阻封接，因此在电极尖端覆盖下的那片膜，在电学上已与膜的其他部分相互分隔。电极尖端下的膜通道开放所产生的电流流进玻璃微电极吸管，通过一个极其敏感的膜片钳放大器，就可测量得到单一离子通道电流。目前，膜片钳技术的研究对象不仅局限于离子通道，已经发展到对离子泵、交换体以及可兴奋细胞的胞吞胞吐机制的研究。膜片钳技术的应用也极其广泛，在神经科学、心血管科学、药理学、细胞生物学、病理生物学、中医药学、植物细胞生理学、运动生理学、药物研发、药物筛选等方面发挥着重要作用。本文将就膜片钳技术在室性心律失常研究方面的功能加以阐述。 膜片钳记录结果显示，室壁中层的心肌细胞，即M细胞具有独特的电生理特性：如较负的静息电位、较大的O相上升速度、动作电位呈典型的“峰和圆顶且时程很长，无4相自动除极等，这些特点决定了M细胞在折返性心律失常发生中起重要作用。近年来研究心律失常的机制趋向于从膜通道活性异常来阐明。 传统的折返概念认为，折返环路上激动的传导依靠的是0期去极化电流，毗邻细胞的去极化也只能由0期电流介导（即0期折返）。后来发现折返的发生也可以由2期平台期电流介导，并提出“2期折返”的概念。所谓“2期折返”，其细胞机制为：在某些病理状态下，心外膜细胞的瞬间外向钾电流Ito绝对或相对增加，使心外膜某些细胞1期复极终止在较负的电位水平，此时Ito迅速失活而Ica缓慢激活，使2期平台期延迟和缓慢出现，延迟整流钾离子电流Ik依次延迟激活，导致2期振幅增大，顶部后移，复极3期随后发生，因此动作电位时程显著延长。而在心外膜的另一些细胞，由于Ito电流强大，使1期复极终止于更负的电位水平，此时膜电位低于Ica的阈电位，外向电流（Ito和Ik）, 故可应用钠通道阻滞剂( Ⅰ类) 、受体阻滞剂( Ⅱ类) 、钾通道阻滞剂( Ⅲ类) 、钙通道阻滞剂( Ⅳ类) 来治疗心律失常。虽然抗心律失常的药物很多，但一种药物可能作用于几种通道,往往同一种药物对不同通道的阻滞作用也有很大差别，药物剂量的限定更是一大难题。为此，抗心律失常药物的筛选和药量的界定就显得格外重要。 在通道电流记录中，可分别于不同时间、不同部位施加各种浓度的药物，研究它们对通道功能的可能影响，了解那些选择性作用于通道的药物影响生理功能的机理。这是目前膜片钳技术应用最广泛的领域，既有对西药药物机制的探讨，也广泛用在重要药理的研究上。依据室性心律失常的患病机制，采用全细胞膜片钳技术直接记录不同药物及其不同浓度对心室中层M细胞各种离子通道的影响，从而能选择出最为有效的治疗药物和最为合适的服用剂量。近年来研究出的新型III类抗心律失常药物一伊布利特就是通过这种方式发现的。 应用全细胞膜片钳记录技术直接记录伊布利特对心室中层M细胞快钠通道的影响，从而探讨其抗室性心律失常的部分离子通道机制。运用该记录方法，记录伊布利特高浓度组(10_5mol／L)及低浓度组(10—6mol／L)干预下心室中层M细胞钠通道活性的变化，包括钠通道电流-电压曲线、稳态失活曲线及失活后再恢复曲线。并与正常对照组进行比较分析。电流记录的刺激程序由pulse+pulsefit软件控制，通道信号经EPC一9膜片钳放大器放大，通过Ag—AgCI电极丝和填充电极内液的微电极导入细胞，产生的电流信号经EPC-9转换，为pulse+pulsefit软件采集、分析。结果显示，伊布利特抗室性心律失常的电生理机制之一是通过阻断钠通道，并进一步使：①可激活的钠通道数量减少，细胞膜的阈值降低，兴奋