RAGE、NFκB基因表达与非缺血性糖尿病足坏疽发病关系及研究.pdfVIP

中华中医药学会周围血管病分会第三次学术大会论文集 K RAGE、NF B基因表达与非缺血性糖尿病足坏疽发病关系的研究 辽宁中医药大学附属医院血管外科李大勇 吕延伟 研究资料表明，我国糖尿病患者中下肢坏疽的发病率为2．6％…，其中截肢率可达4096，且 随着局部感染、缺血的加重，病人的累积病死率明显升高，由此带来了巨大的医疗耗费，也是 一个世界性的难题幢1。本研究观察了非缺血性糖尿病足坏疽患者局部晚期糖基化终产物受体 K B(NF (RAGE)、核转录凶子一K B)基冈表达的状况，并探讨其基凶表达水平的变化在非缺血 性糖尿病足坏疽发病中的可能作用。 1临床资料 糖尿病足坏疽患者15例，年龄45～65岁，男6例女9例，入院时随机血糖10．4～ (0．98±O．07)，均符合中华医学会糖尿病分会第1届全[目糖尿病足学术会议制定的糖尿病足诊 断标准【3。，足部肿胀疼痛，皮肤紫暗，溃破腐烂，肉色不鲜，脓出臭秽。非糖尿病外伤行膝下 或膝上截肢患者4例作为对照。糖尿病足患者清创时取切开创口处全层皮肤一块，对照患者术 中取足部全层皮肤一块，组织离体后，迅速用生理盐水漂洗，置于液氮中冻存。操作过程中注 意防止RNA酶的污染。 2方法 K 2．1RAGE、NF B基因的mRNA表达：采用实时PCR(Real—TimePCR)检测方法，Trizol u uLcDNA 法提取总RNA，20L反转录反应体系中经特异性引物(详见表1)反转录成cDNA，以l Real_Time 为模板，以磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内参照，ABl7500PCR仪器中反应，反应 S，95℃变性5S，60℃退火34S，40个循环，95℃15S，60℃1min。 参数：预变性95℃30 Real—Time 反应结束后，由7500 PCR软件自动记录荧光曲线并分析计算出Ct值，检测被测样 品RNA的完整性和可靠性，应用△△Ct[(样品Ct均值一内参照Ct均值)一(对照样品Ct均值一 对照内参照ct均值)]方法进行相对定量，然后取2““‘即代表被检样品初始mRNA的含量。 Real-Time 表1 PCR引物序列 基冈名称 引物序列 RAGE F：5’一AGGAGGAAGAGGAGGAGCGT一3’ ATA R：5’一TGGC从GGTGGGGTT CAG一3’ K NFB F：5’一OGCAGAAGCTATA耵AOG一3’ R：5’一TATGCACAAATCAGT GAG一3’ GGTG从GGTCGGAGT GAPDH F：5’一GAA C一3’ GGG R：5’一G从GATGGTGAT ATTT-3’ 2．2 Western蛋白质印迹：参照《分子克隆实验指南》H1配制细胞裂解液，剪碎组织后机 械和超声匀浆，12000rpm4℃离心lh，考马斯亮蓝染色法测定总蛋白质浓度，并将各组蛋 白质浓度调到同一水平。样品中加入样品缓冲液，沸水煮5min，置于12％SDS电泳。然 V，i0