cDNA文库的构建及其在畜牧业中的应用.pdfVIP

综述与专论 2014年全国养羊生产与学术研讨会议论文集 9 cDNA文库的构建及在畜牧业中的应用 左兆云，罗海玲 (动物营养国家重点实验室，中国农业大学动物科技学院，北京 100193) eDNA文库是研究基因组学的基本工具之一。自从量包含所有的感兴趣的序列；②含有较少的小片段cD． 70年代中期获得第一个互SbDNA克隆以来。己经用不 同方法提高了eDNA的合成效率．并且对克隆载体也进cDNA文库质量的评价主要从文库的代表性和重组cD． NA片段的序列完整性方面来鉴定t61。文库的代表性是 行了多方改进。目前，将poly(A)+RNA反转录为eDNA， 并插入载体构建eDNA文库已经成为真核分子生物学指文库中所包含的重组eDNA分子能否完整地反映出 的基本手段。由于eDNA文库比基因组DNA文库小得来源细胞中的全部表达信息，计mRNA的种类，可以用 多．能够较容易地从中筛选克隆得到细胞特异性表达 文库的独立克隆数即库容量进行衡量。这是评价eDNA 的基因．因此在基因的克隆和筛选方面具有很大的优 文库质量的最重要的指标。来源细胞中表达出的mRNA 的种类及每种mRNA序列的拷贝数决定了文库的库容 势Ol。cDNA文库在基因表达、功能鉴定、克隆等研究方 面的特殊优势．使其在保护畜禽种质资源的研究中具 量。代表性完好的eDNA文库应满足的库容量取决于来 有更为广泛的应用价值。 源细胞中表达出的基因序列的总复杂度。由于在eDNA lc埘忱文库的分类 文库的实际构建中存在多种操作误差和系统误差．一 根据表达类型的不同．eDNA文库可分为克隆文库 和表达文库；根据载体的不同，又可分为噬菌体文库和 以上的库容量川。 质粒文库。eDNA文库构建全长cDNA文库的方法目前 质量的重要指标。要从文库中分离获得目的基因完整 主要有CAPture法[21、Oligo—c印ping法闭、Cap-tmpper法-t4j、 SMARl[i去[51．各种构建方法的优缺点对比见表1。的序列信息和功能信息．就要求文库中的重组eDNA文 获得全长cDNA．目前用的比较多的是SMART方 库片段尽可能完整地反映出基因的天然结构。所以，大 法。构建全长eDNA文库的SMART原理如下嘲：即在合成 克隆。 eDNA的反应中事先加入的3’末端带Oligo(dG)的 3 SMART引物．由于逆转录酶以mRNA为模板合成cD．cDNA文库的应用 随着eDNA文库构建方法的不断发展和普及．近年 NA．在到达mRNA的5’末端时碰到真核mRNA特有的 “帽子结构”．即甲基化的G时会连续在合成的eDNA末来构建cDNA文库已经成为分离克隆相关性状基因的 首选方法．在功能基因组学的研究中起着十分广泛的 端加上几个(dC)，SMART引物的Oligo(dG)与合成cD． NA末端突出的几个C配对后形成eDNA的延伸模板．逆 基础性作用。eDNA文库应用主要包括以下几个方面： 转录酶会自动转换模板．以SMART引物作为延伸模板3．1筛选与性状相关的重要基因 继续延伸eDNA单链直到引物的末端．这样得到的所有 个特定时期特定的组织细胞所表达的基因．排除了基 cDNA单链的一端有含Oligo(dT)的起始引物序列。另一 端有已知的SMART引物序列．合成第二链后可以利用因组文库中内含子序列对筛选