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生物化学实验指导 （补充讲义） 南方医科大学 生物化学与分子生物学实验教学中心 二 OO 九年十一月 目 录 实验三 血清（血浆）脂蛋白的测定……………………………………………… 1 实验四 蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳……………………………………………… 4 实验六 肝糖原的提取、鉴定与定量（操作考核）………………………………… 10 实验七 质粒 DNA 的提取、定量、酶切与PCR 鉴定……………………………… 16 实验九 总 RNA 的提取、定量与RT-PCR………………………………………… 26 实验十 生物化学自主设计性实验…………………………………………………… 32 实验三 血清（血浆）脂蛋白的测定 目的： 掌握磷钨酸镁沉淀法测定高密度脂蛋白-胆固醇 HDL-C 的基本原理，熟悉磷钨酸镁沉淀 法测定 HDL-C 的手工法操作过程。了解磷钨酸镁沉淀法测定 HDL-C 对判断高脂血症、预防动 脉粥样硬化和冠心病的重要生理意义。 原理： 在脂蛋白中既有蛋白质又有胆固醇，还有磷脂的复合体，较难定量。由于其中的胆固醇 含量较为稳定，因此目前以测定脂蛋白中胆固醇总量的方法作为脂蛋白的定量依据，即测定 HDL、LDL 或VLDL 中的胆固醇，并分别称为高密度脂蛋白-胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白- 胆固醇（LDL-C）或极低密度脂蛋白-胆固醇（VLDL-C）。 测定血清 HDL-C 时，通常需根据各种蛋白的密度、颗粒大小、电荷等，采用超速离心法、 色谱法、电泳法、化学或免疫沉淀法将 HDL 与其他脂蛋白分离开，然后测定 HDL组分中胆固 醇的含量。美国疾病控制与预防中心（CDC）测定 HDL-C 的参考方法为超速离心法。此法主 要用于靶值的确定及各种 HDL-C 检测方法学评价，但因需特殊仪器，对技术操作要求高，一 般实验室难以开展。色谱法和电泳法因仪器、操作要求高等种种原因临床常规实验室也较少 应用，多用于脂蛋白的研究。 临床实验测定HDL-C的方法大致分为以下三类。第一类为化学沉淀法。常用的沉淀剂为 聚阴离子/多阴离子，如磷钨酸（PTA）、硫酸葡聚糖（DS）、肝素或非离子多聚体如聚乙二醇 2+ 2+ 2+ （PEG）与某些两价阳离子（Mg、Ca 、Mn ）联合使用。最早为美国国立卫生研究院（NIH） 所采用的肝素-锰沉淀法（HM法），后多采用硫酸葡聚糖- Mg2+ 2+ （DS- Mg法）。欧洲则多采用 磷钨酸-镁沉淀法（PTA- Mg2+法）和聚乙二醇沉淀法(PEG法)。1995 年中华医学会检验分会 曾在国内推荐PTA- Mg2+法作为HDL-C测定的常规方法。但此类方法常因含apoB的脂蛋白组分， 沉淀不完全而导致结果假性偏高。第二类采用简便的磁珠DS- Mg2+法，省去了离心步骤，但 需要特殊装置和试剂而不适于推广应用。第三类为匀相测定法，即直接测定法。其特点为： 标本用量少，不需沉淀处理，可用于自动生化分析仪测定，在准确度和精密度方面基本达到 美国国家胆固醇教育计划 （NCEP）的分析目标，因此在短短的数年里迅速为临床实验室采用。 磷钨酸-镁沉淀法测定高密度脂蛋白-胆固醇：采用大分子多阴离子化合物（磷钨