套式PCR与测序方法用于痰标本中结核分枝杆菌rpoB耐药基因突变检测.pdfVIP

细胞能转化成具有吞噬作用的巨噬细胞，巨噬细胞具有特效抗结核作用。结核分支杆菌 类脂质能使幼龄活性巨噬细胞转化为类上皮细胞，或郎罕巨细胞，并与淋巴细胞、浆细胞 及纤维细胞、网状纤维、胶原蛋白等形成结核性肉芽肿。因而结核性胸腔积液游离的间皮 细胞可明显减少或消失。 胸腔积液中进行间皮细胞计数方法简单易行、经济。对缺乏实验条件的基层单位有 一定价值，值得推广。如果结合临床特点排除脓胸及胸腔内硬化剂注射史，那么间皮细胞 减少或消失对诊断结核性胸腔积液有意义。 参考文献： (1)崔祥殡，王鸣歧，萨藤三，主编．实用肺脏病学(M)．上海：上海科学技术出版社，1991．18-19． (2)张敦华，主编．实用胸膜疾病学[M]．上海：上海医科大学出版社，1997．116-119． (收稿日期：2000—07—03) 套式PCR及测序方法用于痰标本中 结核分枝杆菌rpoB耐药基因突变检测 熊国亮 张慧慧 刘珍琼 江西省胸科医院，南昌330006 2000年我国进行了第四次全国结核病流行病学抽样调查。结果表明，我国肺结核患 者的耐药率高．耐多药率为10．7％．尤其是对利福平耐药率有所增加…。利福平(RFP)是 最重要的抗结核药物之一，由于多数利福平耐药菌同时也对其他药物耐药，因此利福平 耐药性可以作为判定耐多药结核菌(MDR—TB)的一个非常好的指标【2J。研究证实利福平 耐药90％一95％是由于药物作用靶分子RNA多聚酶p亚单位编码基因突变绝大部分集 中在81bp的利福平耐药决定区【3】。近年来国内外学者较多用PCR—SSCP方法研究结核 分枝杆菌临床分离株rpoB基因突变与利福平耐药性关系，该方法仍然需要结核分枝杆 菌长时间的培养分离。本研究采用套式PCR及DNA测序方法直接快速检测临床痰标本 中结核分枝杆菌rpoB基因突变，从而了解其对利福平的耐药性。 材料与方法 一、材料 ．112． 断的活动性肺结核(根据临床症状、体征、胸部X线、细菌学检查等确诊)住院病人；呼吸 科、肿瘤科20例非结核性肺部疾病(慢性支气管炎5例，肺炎、肺部感染9例，肺癌6例) 的住院病人，嘱患者(结核患者停抗痨药三天)留取晨痰2—5ml送检。 2．标准结核分枝杆菌菌株H37Rv由中国药品生物制品检定所提供。 3．套式PCR试剂：由无锡市克隆遗传研究所提供，外套引物(Pl、P2)和内套引物 GAC-3’；P2 (P3、P4)如下：P15’一CGTGGAGGCGATCACACCGCA 5’一CGTGGAGGCGATCACACCGCA5’一GAC— GCACGTCGCGGA-3’；P3 GACG-3’；P4 CTCCAGC CCGGCACGCTCACG一3’。 4．改良罗氏培养基及药敏培养基自配。 二、方法 1．痰涂片抗酸染色及罗氏培养，绝对浓度药敏试验，菌型鉴定操作方法参见《结核病 诊断细菌学检验规程》。 即为第一次扩增的模板。 3．外套PCR扩增：在外套反应体系的每管中加入相应的第一次模板液5斗l，石蜡油 倍稀释，即为第二次扩增的模板。 4．内套PCR扩增：在内套反应体系的每管中加入相应的第二次模板5td，石蜡油 60s．循环35周期，最后一个循环的72℃延长至5min。 5．取第二次扩增产物101山1与21xl溴酚兰指示剂混匀，点样于2％琼脂糖凝胶(内含 溴乙锭)以100伏电压电泳20—30min，在紫外透射仪上与DNA Marker对照出现193bp 荧光带者为结核分枝杆菌rpoB阳性。条带清晰者可作为DNA测序分析。 周期。读序在ABl377型测序仪上进行。同时与标准结核分枝杆菌扩增相同rpoB基因片 段产物测序序列进行比对。 7．涂片抗酸染色、罗氏培养、套式PCR扩增rpoB基因均采用患者的同份晨痰标本 进行。 结